抗凍蛋白的研究現狀及其應用

陳闖，姚駿，王麒琳，張弘（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

抗凍蛋白的研究現狀及其應用

陳闖，姚駿，王麒琳，張弘
（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

從抗凍蛋白的來源、研究歷程進行闡述，并對抗凍蛋白的作用機理、應用領域進行綜述，以期為抗凍蛋白的工業化開發應用提供參考。

抗凍蛋白；原理；應用

抗凍蛋白（AFPs）是一類具有提高生物抗凍能力的蛋白質類化合物的總稱。自二十世紀發現以來，研究范圍先后從魚類，昆蟲，轉移到植物材料上來[1]。

抗凍蛋白吸附在冰晶表面，通過EAFC3效應抑制其生長。機制的模型為：一般晶體的生長垂直于晶體的表面，假如雜質分子吸附于冰生長通途的表面，那么需要在外加一推動力（冰點下降），促使冰在雜質間生長。由于曲率增大，使邊緣的表面積也增加。因表面張力的影響，增加表面積將使體系的平衡狀態發生改變，從而冰點降低[2]。本文從抗凍蛋白的研究歷程、抗凍原理及其應用作一綜述，為抗凍蛋白的工業化應用提供參考。

1　抗凍蛋白的來源及研究歷程

1.1來源

從20世紀70年代科學家首次從極地魚體的血液中提取出抗凍蛋白以來，經過幾十年的研究發展，人們相繼從動物、植物、微生物中都發現了具有同樣功能的蛋白質。它們都具有一定的抗凍活性，但在組成和結構上卻各不相同，在基因序列上也沒有同源性，因而造就抗凍蛋白的多樣性和復雜性[3]。

從微生物中分離提純抗凍蛋白的研究相對較少。目前已知的從大腸桿菌中分理出的抗凍蛋白分子量大約為7.4 Ku[4]，含大量的親水基團；從莫拉氏菌株中分離出的抗凍蛋白是是第一次有報道的抗凍脂蛋白；另外，有研究者還在北美地區的一種根瘤菌中發現了一種抗凍蛋白。真菌中抗凍蛋白的研究相對來說非常少，有報道稱在香菇和牡蠣菇中存在著抗凍蛋白[5]。

相對于魚類、微生物，植物中抗凍蛋白的研究相對較晚一些，但是植物性抗凍蛋白在應用中更容易為人們所接受。植源性的抗凍蛋白原料主要分布于南北回歸線以外高緯度地區以及高山高寒高海拔的地區，常見的有高山雪蓮、黑麥草、內蒙古生沙冬青等，這些原料存在成本過高或穩定性差等不足。

近年來相繼在昆蟲、植物（如冬黑麥、沙冬青、唐古特紅景天葉等）體內也發現有類似功能的抗凍蛋白。至今魚類的AFP基因的轉化植物已獲成功；與植物中類似AFP基因在微生物體內克隆也獲得成功。推測植物抗凍分子生物學和培植農業上抗凍新品種的前景必定是光明的。現已發現5種，包括抗凍糖蛋白、抗凍蛋白Ⅰ、抗凍蛋白Ⅱ、抗凍蛋白Ⅲ、抗凍蛋白Ⅳ[6]。

1.2研究歷程

20世紀50年代加拿大科學家Scholander第一次在北極魚體中發現抗凍物質的存在。20世紀60年代末，生物學家Arthur DeVries從南極魚類體內首次分離抗凍蛋白。1977年Raymond和DeVries提出關于抗凍蛋白抗凍機制著名的吸附抑制模型。1992年Griffith等在冬黑麥（winterrye）的葉子中發現了AFP[7]。2002年Bindslev等研究了抗凍蛋白的過敏性，斷定AFP不會引起過敏反應，是一種安全的食品添加劑，可以放心使用。2004年，Unilever將分離自魚類并且在酵母中大規模復制的APF應用于Breyers品牌的輕雙攪雪糕中，取得良好的效果，并獲得FDA認可。2006年我國首次在食品安全國家標準GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》上公布抗凍蛋白可以以新的食品添加劑添加到冷凍食品中。

2　抗凍蛋白的作用學說[8]

2.1吸附抑制學說

吸附抑制學說最早在1977年由Raymond和Devries提出，認為抗凍蛋白吸附在冰晶表面通過Kelin效應抑制其生長。吸附抑制學說認為大多時候抗凍蛋白濃度越高抗凍效果越好，抗凍蛋白的抑制重結晶作用對保護大體積細胞有利，但其實抗凍蛋白對小體積細胞也能起到保護作用。但此學說忽略了抗凍蛋白與細胞膜相互作用、抗凍蛋白之間、抗凍蛋白和冰晶復合體之間的團聚作用等。

2.2“偶極子—偶極子”學說

該假說在1988年由Yang等提出，認為AFPs具有顯著平行于其螺旋軸親水基團和疏水基團的偶極子。

2.3氫原子結合模型

AFP分子一側是相對疏水，另一側是相對親水，二維陣列顯示是親水一側與冰相結合，而疏水一側與水相作用。氫原子結合模型認為AFPs結構中的氫原子與冰晶上的氧原子匹配并結合，具有很高的冰結合專一性，而其自身的氨基酸組成和螺旋結構有利于提高結合的穩定性。

2.4剛體能量學說

把AFP視為小粒子，根據表面能最小原理以及“AFP—冰”與“AFP—水”界面之間的表面能差異，AFP能強烈吸附在冰晶表面上。即使分子與冰水無優先結合，當抗凍分子存在時，由于冰-水表面積縮減，AFP也能強烈吸附冰晶。另外，AFP必須與冰晶相匹配，否則就會使水分子擴散至界面，隨著冰晶的增長同時使蛋白向前推進。水分子在粒子后擴散，推進粒子向前，在溶液中形成冰晶體。通過這種方式，即使超過過冷卻溫度1℃或更小，也會產生很大的壓力。

2.5冰核抑制學說

冰核是形成冰晶的基礎，沒有冰核的存在，冰晶就不可能生長。冰核抑制學說是近年來對抗凍蛋白作用機制的一種新的見解和補充。2003年Ning Du等通過試驗具體闡述了這種作用機制，首次發現抗凍蛋白可以通過吸附在灰塵和冰核的表面，減少它們之間的聯合來抑制新的冰核形成。

3　抗凍蛋白的應用

冷食業在食品工業中所占的份額越來越大，低溫冷鏈中眾多食品發生結晶和重結晶現象對細胞組織結構發生破壞作用，造成細胞內汁液流失。水的結晶導致溶液局部濃縮現象又促使細胞內組分的性質發生改變，發生蛋白質變性、淀粉回生等現象，這些現象最終使產品品質受到嚴重破壞。作為一類新型的食品添加劑，抗凍蛋白可以有效減少冷凍貯藏的食品中冰晶的形成和重結晶，從而提高低溫冷鏈系列食品的質量。

3.1在食品領域的應用

3.1.1在冷凍乳制品中的應用

評價冰淇淋質量高低的一個重要的指標是其中的冰晶體越細小越好。如果在冷藏、運輸、銷售任何一個冷鏈環節出現較高的溫度就會發生重結晶現象，生成較大的晶體，從而影響冰淇淋的口感．添加抗凍蛋白可以有效防止冷凍貯藏的食品中冰晶的形成。Wang等將冰淇淋經過cold-heat-stage處理后，用顯微鏡觀察冰晶生長情況，結果發現加有抗凍蛋白的冰淇淋樣品冰晶細小且均勻，而未加抗凍蛋白的冰淇淋樣品冰晶大且不均勻。

3.1.2在冷卻/冷凍肉中的應用

肉制品的冷凍、冷藏中，加入AFPs可以有效減少滲水和抑制冰晶的形成，保持原來的組織結構，減少營養流失．據報道，將AFPG于屠宰前注入羔羊體內，宰后肉體經真空包裝，在-20℃凍藏2周～16周，然后解凍，觀察肉的冷凍質量。結果發現，無論在屠宰前1 h 或24 h注射AFPG，都可有效降低冰晶體的體積和液滴的數量。AFPG注射濃度達到0.01 mg/kg時，特別是在宰前24 h注射，可以獲得最小的冰晶體。

抗凍蛋白也可進行人工合成，因其具有潛在的商業價值，美國已通過遺傳路線開發出了這種產品。在食品中的應用還包括保護柑桔果實免受冷凍損傷，保護烘焙品（特別是面包烘焙用酵母，需經歷冷凍—解凍循環和貯存）及啤酒酵母等，抗凍蛋白在冷凍食品領域的應用被認為幾乎是無限的。

3.1.3在冷凍面團技術中的應用

冷凍面團技術是一種烘焙食品加工新技術，一方面由工廠進行面團攪拌、切塊、成型、冷凍，另一方面由烘焙房、超市、快餐店在需要時進行解凍、醒發和烤制。然而，冷凍面團經過長時間凍藏，面團的品質會下降，如醒發時間延長，面包比容減小等。Zhang等研究了抗凍蛋白對冷凍面團質地特性的影響，結果發現，添加抗凍蛋白的試驗組冷凍面團的硬度比對照組更加柔軟和穩定，這主要是因為較低的結冰水含量。食品在低溫貯藏、運輸等過程中，抗凍蛋白能有效地抑制冰晶的形成和重結晶化，而使食品保持質地的柔軟性，并能減少滴液防止營養成分的損失。目前，由于抗凍蛋白的售價很高，僅適宜于研究和專門的應用，因此，如何不斷地降低抗凍蛋白的成本，是實現其在食品工業中廣泛應用的關鍵。

3.2在農業領域的應用

抗凍蛋白對防止農作物被低溫破壞有明顯的效果，通過抗凍蛋白的轉基因作物的種植，可以改進農作物的產量和質量，延長作物的生長季節和栽種范圍，同時也會改善作物在收獲后的儲藏加工特性。

3.3在醫學領域的應用

AFP可用于人和動物的卵、精子、胚胎或肝臟等器官的超低溫保存，改善其冷凍質量。王君暉和黃純農對抗凍蛋白在細胞的低溫和超低溫保存中的作用進行了研究，得出一些有益的結論：在某些情況下，抗凍蛋白可能不利于某些樣品的低溫和超低溫保存，其中機制尚需繼續探討。

3.4在工業領域的應用

AFP在工業上可作為一種高級防凍劑而得已應用，例如AFP溶液可以用于高速公路的防凍養護等。

綜上所述，抗凍蛋白具有極其廣闊的應用前景，今后應加強抗凍蛋白的應用研究，應以抗凍蛋白的化學合成和基因工程為突破口，實現抗凍蛋白的規模化生產，將抗凍蛋白應用到各個領域中去。

[1]張暉.抗凍蛋白在食品中應用研究進展及安全性分析[J].食品與生物技術學報,2012,31(5):455-457

[2]汪少蕓,李曉坤,周焱富,等.抗凍蛋白的作用機制及基因工程研究進展[J].北京工商大學學報,2012,30(2):58-63

[3]黃福貞,韓花翠,曾曉林.植物抗凍蛋白及其應用[J].生物學教學, 2000,25(12):35-36

[4]張黨權,劉兵,范云,等.胡蘿卜抗凍蛋白在大腸桿菌中的高效表達[J].中山大學學報(自然科學版),2003,42(3):53-56

[5]樊紹剛,張黨權,鄧順陽,等.抗凍蛋白和冰核蛋白對植物抗凍性能的作用機制[J].經濟林研究,2009,27(2):125-130

[6]李芳,王博,艾秀蓮.抗凍蛋白研究進展[J].新疆農業科學,2003,40 (6):349-352

[7]彭筱娜,易自力,蔣建雄.植物抗寒性研究進展[J].生物技術通報, 2000(4):15-18

[8] 彭淑紅,姚鵬程,徐寧迎.抗凍蛋白的特性和作用機制[J].2003,34 (3):238-240

The Research Status and Applications of Antifreeze Proteins

CHEN Chuang，YAO Jun，WANG Qi-lin，ZHANG Hong
（Tianjin Food Research Institute Co.，Ltd.，Tianjin 301609，China）

From the source of the antifreeze proteins，elaborates the research process，and the mechanism of antifreeze proteins，the applications were reviewed，in order to provide references for the developmentofindustrialization and application ofantifreeze proteins.

antifreeze proteins；the principle；application

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.046

天津市科技計劃項目（14ZCZDTC00021）

陳闖（1988—），男（漢），助理工程師，本科，研究方向：化學工程與工藝。

2016-05-04