PCR技術在食源性微生物檢測中的應用與發展研究

孫吉浩

（寧波市北侖區疾病預防與控制中心，浙江寧波315000）

PCR技術在食源性微生物檢測中的應用與發展研究

孫吉浩

（寧波市北侖區疾病預防與控制中心，浙江寧波315000）

食源性微生物檢測技術在引入聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術后得以迅速發展，經歷了常規PCR檢測技術、多重PCR檢測技術、熒光定量PCR檢測技術等3個變化階段。本文基于PCR技術的發展階段和現狀，闡述常規PCR檢測技術、多重PCR檢測技術、熒光定量PCR檢測技術3種檢測技術的原理，并對3種PCR技術在食源性微生物檢測中的應用進行詳細分析，提出將PCR技術應用于食源性微生物檢測存在的問題及展望。

PCR技術；食源性微生物檢測；應用；發展

食品安全事關生命健康和社會穩定。維護食品安全，對食品安全進行有效快速的監測是檢疫機構的重要責任和主要工作。食源性致病微生物是導致食品安全風險的一個主要來源，對于食源性致病微生物的控制近年來日益受到關注。食源性致病微生物的檢測方法一直在革新推進，傳統的檢測方法存在周期冗長、繁瑣復雜的缺點，近年來發展起來的新技術克服了這些缺點，具有快速、簡潔等優點，因此受到專家學者的青睞。

食源性微生物檢測技術在引入PCR技術后得以迅速發展，經歷了以下的變更過程：常規PCR檢測技術、多重PCR檢測技術、熒光定量PCR檢測技術等3個變化階段，每一階段的技術革新都產生了實質性的突破[1]。本文基于PCR技術的發展階段和現狀，闡述常規PCR檢測技術、多重PCR檢測技術、熒光定量PCR檢測技術3種檢測技術的原理，對3種PCR技術在食源性微生物檢測中的應用進行詳細分析，最后提出將PCR技術應用于食源性微生物檢測存在的問題，并對其進行展望。

1 PCR技術在食源性微生物檢測中的應用

1.1 PCR技術的原理與發展綜述

PCR檢測技術根據發展情況主要可以分為三類：常規PCR檢測、多重PCR檢測、熒光定量PCR檢測。3種檢測技術的原理存在一定差異，應用時所用到的特點也各不一樣，導致PCR檢測技術的應用性能具有一定的差異化。下面將結合3種檢測技術各自的原理對其予以解析。

1.1.1 常規PCR檢測技術

常規PCR檢測又稱為傳統PCR檢測技術，其主要原理是：以熱穩定DNA聚合酶作為催化劑，以引物、DNA模板、dNTP、適當緩沖液與MgCl2溶液作為反應混合物，對1對寡核苷酸引物所界定的DNA片段進行擴增[2]。常規PCR檢測技術可以衍生出多重PCR技術及熒光定量PCR檢測技術。

1.1.2 多重PCR檢測技術

多重PCR的檢測原理與傳統PCR基本類似，其區別在于：如果存在與各引物對特異性互補的模板，只不過是在同一反應體系中加入1對以上的特異性引物，那么就可以同時在同一個反應管中擴增出1條以上的目的DNA片段。使用這一方法可以同時檢測1個以上目的基因或者借助其交叉限制進行確認。

多重PCR檢測技術的特點包括高效性、系統性、經濟簡便性[3]。多重PCR檢測技術執行快速，具有完備的檢疫系統，花費成本低，操作簡易，可以作為食源性微生物檢測較為理想的檢測技術。

1.1.3 熒光定量PCR檢測技術

熒光定量PCR是近年來發展起來的一項新技術。熒光定量的主要原理是利用傳統多聚酶鏈式反應儀應用熒光能量傳遞技術，通過某種化學相互作用（主要是受體發色團之間偶極-偶極相互作用）來產生效果。靶序列初始濃度從檢測PCR的過程得知，能量從供體發色團轉移到受體發色團，受體熒光染料發射出的熒光訊號強度與DNA產量成正比，從而達到定量目的。相較于常規PCR檢測技術、多重PCR檢測技術，熒光定量PCR檢測技術的化學原理有了一定程度的創新和改進。

熒光定量PCR檢測技術通過電腦軟件實現實時在線檢測PCR擴增過程，進而得到最終檢測結果，而無需再次檢測擴增產物，從而避免了污染。因此，熒光定量PCR檢測技術具有環保、特異性好、靈敏度高等優點。另外，熒光定量PCR檢測技術還可以實現“一管多檢”。這些不可替代的優點和性能使得熒光定量PCR檢測技術在食源性微生物檢測中具有舉足輕重的地位，并成為具有創新性的一種檢測手段。

1.2 PCR技術在食源性微生物檢測中的應用分析

PCR技術在食源性微生物的檢測中具有重要的作用，隨著PCR技術的不斷發展和創新，食源性微生物的檢測也不斷取得新的進展，常規PCR檢測、多重PCR檢測、熒光定量PCR檢測3種檢測技術在食源性微生物的檢測中具有不同的作用和功能。現將結合3種技術的原理分別介紹其應用。

1.2.1 常規PCR檢測技術在食源性微生物檢測中的應用

PCR技術最早被應用于分子生物學研究與醫學診斷領域，并發揮了重要作用。20世紀80年代中期開始，PCR技術被逐漸應用于食品微生物的研究與檢測。PCR技術的出現，實現了“在生物體外對特定核酸片段的擴增”的功能。傳統的PCR反應循環包括以下3個過程：1）高溫下雙鏈DNA分子的變性；2）對人工合成的引物在特定溫度下與變性的單鏈DNA退火；3）堿基在DNA聚合酶的作用下以靶序列為模版延伸。在經歷反復循環之后，即可獲得呈指數增長的特定DNA序列片段拷貝。特異性的擴增產物可以經由DNA熒光染料處理，通過凝膠電泳等方法進行觀察。PCR檢測方法中，DNA樣品的準備、PCR反應、反應產物的鑒定可在前增菌后的1d內完成，而傳統的微生物學檢驗方法大概需要消耗4～10d的檢驗時間，多管發酵、梯度增菌以及選擇性培養基的轉接等操作過程繁冗，相較之下，PCR法有著明顯的快速優勢。PCR反應對于特異性目的片段的擴增相比于選擇性培養、單克隆挑選等方法，產生假陽性的概率降低，檢測的準確性強。在靈敏度方面，大多數PCR體系對于食源性微生物的檢出限可以達到10～104CFU/mL，而傳統微生物學的檢出限約為104CFU/mL。多方面的優點使PCR技術迅速被諸多的食源性微生物研究所采用，到20世紀90年代中期，包括空腸彎曲桿菌、大腸菌群、單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌屬等多種常見食源性微生物的PCR檢測方法已得到初步建立和發表。在研究應用過程中，PCR檢測的一些缺點和局限性也得以體現并受到關注。一方面，PCR產物中的陽性結果是通過擴增條帶的大小來判斷，而引物設計的缺陷有可能會導致非特異性條帶的產生，對結果判斷產生干擾甚至產生假陽性結果；另一方面，食品中存在的某些成分如鈣、鎂離子螯合劑、DNA酶或DNA聚合酶抑制物等可能對PCR反應產生抑制作用，使檢測結果呈現假陰性。此外，普通PCR技術本身無法區分食源性微生物是否為活體。

1.2.2 多重PCR檢測技術在食源性微生物檢測中的應用

近年來，許多與致病相關的基因在對食品病原細菌致病機理的研究中被陸續發現，這些基因絕大部分都是該菌所特有的。根據這些特異性的基因設計合適的引物，擴增其高度保守區成為了應用多重PCR方法檢測食品病原細菌的關鍵[4]。目前，在食品病原細菌檢測中對于多重PCR技術的應用主要包括2個方面：單一病原細菌的檢測和多種病原細菌的同時檢測。

對如沙門氏菌、致病性大腸桿菌這類血清型較復雜的病原細菌，常規的單一PCR檢測由于其特異性差，具有一定的局限性因而容易出現假陽性。若想提高特異性，減少假陽性，就需要再多重PCR選擇目的病原細菌多個高度保守的基因序列設計引物進行擴增。

若想快速實現多種病原細菌的同時檢測和分析，可以在同一PCR反應管中同時加入多種病原細菌的特異性引物進行多重PCR擴增。目前大多數病原菌對人感染劑量很低，1～10CFU的菌體細胞就足以對人致病。

1.2.3 熒光定量PCR檢測技術在食源性微生物檢測中的應用

傳統的細菌培養法檢測主要靠形態學、生化反應和血清學凝集等實驗手段，檢測周期長，操作繁瑣，易受主觀判斷影響，在一定程度上會造成漏檢。實時熒光定量PCR技術作為近幾年興起的一種核酸定量分子生物學檢測新技術，可以彌補傳統檢測手段中的不足。實驗研究表明，實時熒光PCR法與傳統培養法相比，具有以下優點：操作便捷，節省時間，特異性強，較為靈敏。

由于PCR技術主要針對生物因子核酸片段，檢測結果不能判斷病原菌的死活狀態，也得不到可以進行活體保存的病原體，從而無法確定檢測到的核酸片段是否來源于具有生物學活性和感染力的病原菌，對于證實感染食源性致病微生物引發食源性疾病不能直接舉證。因此，檢驗結果有時不能作為公共衛生突發事件的病原學診斷依據。鑒于上述情況，建議在實際工作中不妨將實時熒光PCR法和傳統細菌培養法結合起來使用，以便優勢互補。將熒光定量PCR技術應用于食源性致病微生物的檢測是一種理想的檢測方法，有著很好的應用前景和研究價值。

1.3 將PCR技術應用于食源性微生物檢測存在的問題及展望

食源性微生物的檢測仍然是一門很關鍵的食品安全檢疫技術，對于維護人民生命健康、社會穩定具有重要的決定作用。如何利用新技術、新手段盡量消除或減少由于人為因素引起的誤差，提高檢驗結果的準確性和客觀性，同時達到良好的檢測效果，依然是食源性微生物監測工作中的一個重要課題。

1.3.1 PCR技術應用于食源性微生物檢測的優勢

PCR檢測技術目前已經在國際上獲得廣泛的認可，在很大程度上可消除或減少生化鑒定和血清學試驗，許多步驟依靠操作者的主觀判斷等主觀因素造成誤差，并且具有節約時間、簡化工作量的優點，有益于在今后致病微生物檢測中使用。

1.3.2 3種檢測技術各自的優劣綜述

1.3.2.1 常規PCR檢測技術

常規PCR檢測技術的一些缺點和局限性越來越受到人們的關注。第一，PCR產物對結果判斷產生干擾甚至產生假陽性結果；第二，食品中存在的某些成分可能對PCR反應產生抑制作用，使檢測結果呈現假陰性；第三，普通PCR技術本身無法區分食源性微生物是否為活體，因此經過滅菌后的食品中殘存的DNA物質仍有可能被擴增產生假陽性結果[5]。

1.3.2.2 多重PCR檢測技術

多重PCR檢測技術的特點包括高效性、系統性、經濟簡便性。多重PCR檢測技術執行快速，具有完備的檢疫系統，花費成本低，操作簡易，可以作為食源性微生物檢測較為理想的檢測技術。多重PCR檢測技術在實際應用中也存在不少問題，污染問題就是其中之一。一旦有極少量外源性DNA污染,就可能出現假陽性結果；多對引物同時擴增，各種實驗條件控制不當，很容易導致擴增失敗或非特異性產物；引物的設計及靶序列的選擇不當等都可能降低其靈敏度和特異性。

1.3.2.3 熒光定量PCR檢測技術

多重PCR檢測技術在對食品樣品進行檢測時，增菌培養基選擇不當易使有的細菌生長緩慢或被抑制，導致假陰性的結果。熒光定量PCR檢測技術可以避免以上問題的產生，熒光定量PCR檢測技術具有環保、特異性好、靈敏度高等優點。另外，熒光定量PCR檢測技術還可以實現“一管多檢”[6]。這些不可替代的優點和性能使得熒光定量PCR檢測技術在食源性微生物檢測中具有舉足輕重的地位，而成為具有創新性的一種檢測手段。

1.3.3 PCR檢測技術的發展新方向

PCR檢測技術今后的發展方向主要集中在以下幾個方面：1）不斷增加反應體系中引物對的數量，提高一次擴增反應所能檢測的范圍；2）優化反應條件，提高擴增效率；3）研究篩選能同時富集多種病原細菌的培養基；4）與其他技術結合，如熒光PCR、反轉錄PCR，提高檢測敏感性和特異性，縮短檢測時間。

2 結語

食品安全事關生命健康和社會穩定，維護食品安全，對食品安全進行有效快速的監測是檢疫機構的重要責任和主要工作。食源性致病微生物是導致食品安全風險的一個主要來源，對于食源性致病微生物的控制近年來日益受到關注。食源性微生物檢測技術在引入PCR技術后得以迅速發展，經歷了以下的變更過程：常規PCR檢測技術、多重PCR檢測技術、熒光定量PCR檢測技術等3個變化階段，每一階段的技術革新都產生了實質性的突破。本文的研究和展望基于當前食源性微生物的檢測技術現狀，希望可以對PCR技術應用于食源性微生物的情況具有一定的借鑒和參考價值。

[1]方平.PCR技術在食源性致病微生物快速檢測中的應用[J].中國食品工業,2006,21(11):44-46.

[2]張然,董海強,張廷文.食源性微生物PCR檢測技術研究進展及標準化討論[J].山東輕工業學院學報(自然科學版),2010,24(4):8-12.

[3]楊衛軍,張小軍,張坤朋,等.PCR技術在食品微生物檢測中的應用[J].安陽工學院學報,2008,7(4):16-18.

[4]胡金強,雷俊婷,詹麗娟,等.免疫學技術在食源性微生物檢測中的應用綜述[J].鄭州輕工業學院學報(自然科學版),2014,15(3):7-11.

[5]鄧紫筠.多重PCR檢測技術在食品微生物檢測中的應用[J].生物技術世界,2013,7(1):69-70.

[6]左慧彬.食源性致病微生物PCR檢測策略的建立和優化[D].濟南:山東大學,2015.

Application and Development of PCR in the Detection of Food-borne Microorganism

Sun Ji-hao
(Ningbo Beilun District Center for Disease Control and Prevention, Zhejiang Ningbo 315000)

Foodborne microbial detection technology develop rapidly after the introduction of PCR technology, through the following change process: the three stages of change conventional PCR detection technology, multiplex PCR, quantitative PCR technology, every stage of the technology innovations have had a substantial breakthrough. Based on the development stage of PCR technology and the status quo, this paper described conventional PCR detection technology, the principle of multiplex PCR, quantitative PCR technique three detection technology, the three PCR technique in the detection of food-borne microbes were detailed analyzed, the problems and prospects of PCR technology for detecting the presence of food-borne microbes were putted forward.

PCR technique; Foodborne microbial detection; Applications; Development

TS207.5

A

2096-0387（2016）02-0056-03

孫吉浩（1987-），男，浙江寧波人，助理工程師，研究方向：PCR技術。