新型速溶型鈣增強劑的制備和穩定性研究

胡錦華， 陸計萍， 文麗杰， 周 玥， 周 鵬*，2，3

（1．食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122；2．江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；3．江南大學 食品安全與營養協同創新中心，江蘇 無錫214122；4．聚合物分子工程國家重點實驗室，復旦大學，上海200433）

新型速溶型鈣增強劑的制備和穩定性研究

胡錦華1，4， 陸計萍1， 文麗杰1， 周 玥1， 周 鵬*1，2，3

（1．食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122；2．江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；3．江南大學 食品安全與營養協同創新中心，江蘇 無錫214122；4．聚合物分子工程國家重點實驗室，復旦大學，上海200433）

研究了一種由濃縮乳蛋白粉（Milk Protein Concentration Powders，MPC Powders）和難溶性鈣鹽制備得到的新型鈣增強劑（Ca-MPC），通過激光共聚焦掃描顯微鏡、ζ-電位等表征手段證實了此鈣增強劑是蛋白質和難溶性鈣鹽通過分子間弱相互作用形成的復合物，并進一步分析了蛋白質的不同組分與鈣鹽之間相互作用的差異性。另外，對此類鈣增強劑在純水和蛋白溶液中的分散穩定性進行了考察，結果表明，該鈣增強劑在水溶液和蛋白溶液中的懸浮穩定性都有所改善，可作為良好的食品外源性鈣補充劑。

濃縮乳蛋白；碳酸鈣；羥基磷灰石；磷酸三鈣；分子間相互作用

高鈣乳制品不僅含有人體必須的多種營養元素[1-2]，還能提供更多有益于人體的鈣質。外源性鈣強化劑主要分為可溶性鈣和難溶性鈣兩類，兩者應用于乳制品生產中時各有利弊。可溶性鈣由于和酪蛋白之間強烈的相互作用，會造成酪蛋白的橋連絮凝，進而引起乳制品的熱不穩定性。難溶性鈣雖不會造成乳蛋白在熱力學上的不穩定，但其懸浮穩定性差，容易在乳制品中產生沉淀。

人體近50%的骨組織為蛋白質，另外50%為礦物質。大量研究表明鈣與蛋白質對骨骼健康都十分重要。一方面，骨骼需要不斷吸收新的蛋白質來完成生長和重建；另一方面，鈣作為骨骼組成的重要元素，與蛋白質對骨骼健康有協同作用。乳清蛋白能夠明顯增加成骨細胞的增值[3]，酪蛋白水解物能夠增強成骨細胞的基因表達，從而有利于骨骼生長[4]。Hughes和Harris發現在補鈣的同時增加蛋白質的攝入量會對骨組織生長起到正相關作用，骨骼狀況隨著攝入蛋白質的增加呈線性改善，但蛋白攝入量很低時，反而會造成骨損失[5]。因此，當蛋白攝入量不足時，鈣不足以保護骨骼，補鈣的同時攝入充足的蛋白質才能對骨骼狀況起到最好的改善效果。

在食品工業中，通常認為蛋白和難溶性鈣鹽之間不存在相互作用，但是生物材料學領域的研究卻已揭示了難溶性鈣鹽和蛋白質之間存在較為強烈的相互作用[6-7]。作者基于蛋白與難溶性鈣鹽之間的相互作用研究了一種新型鈣增強劑，通過激光共聚焦掃描顯微鏡、ζ-電位等手段表征了該鈣增強劑，并考察了該鈣增強劑的分散穩定性。結果表明，此鈣增強劑在水溶液和蛋白溶液中的穩定性都有所改善，可用于速溶型高鈣乳粉的生產。

1 材料與方法

1.1 材料

濃縮乳蛋白 （Milk Protein Concentration 485）：新西蘭恒天然集團產品；碳酸鈣 （CaCO3）：日本Maruo公司產品；羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）、磷 酸 三 鈣 （tricalcium phosphate，TCP）： 德 國Budenheim化學公司產品；異硫氰酸熒光素（FITC）：美國Sigma公司產品；考馬斯亮藍R-250：國藥集團化學試劑有限公司產品；其它試劑均分析純；實驗用水為超純水。

1.2 主要儀器設備

激光粒度分析儀S3500：美國麥奇克有限公司產品；激光共聚焦顯微鏡TCS SP8：德國萊卡公司產品；激光粒度儀ZetasizerNano-ZS：英國馬爾文儀器有限公司產品；可見分光光度計UV-1200：上海美譜達儀器有限公司產品。

Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra小型電泳槽：美國Bio-Rad公司產品；Gel Doc EZ凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司產品；QB-128旋轉培養器：其林貝爾儀器制造有限公司產品；SevenEasy實驗室pH計：梅特勒-托利多儀器上海有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 新型鈣增強劑的制備 配制濃縮乳蛋白（Milk Protein Concentration，MPC）的水溶液（質量濃度為40 mg/mL），攪拌4 h后在4℃下過夜，使蛋白完全水合。通過稀釋一定量的MPC原始溶液來獲得不同質量濃度的蛋白溶液（1～30 mg/mL），攪拌至少1 h后待用。在1.5 mL的離心管中加入20 mg的難溶性鈣粉末，再加入0.5 mL超純水，超聲10 min后，分別在離心管中加入0.5 mL不同質量濃度的蛋白溶液。將所得到的溶液在室溫下（約20℃）旋轉孵育2.5 h后經7 000 r/min的速度離心15 min將被蛋白包覆的難溶性鈣粉分離出來，用超純水漂洗所得沉淀1次，去除表面松散附著的蛋白，即為制得的鈣增強劑（Ca-MPC）。

1.3.2 鈣增強劑的表面形貌觀察 通過TCS-SP8激光共聚焦顯微鏡對鈣增強劑進行成像分析進一步驗證蛋白質在鈣鹽表面的吸附[8-9]。用異硫氰酸熒光素（FITC）對實驗組和對照組分別染色后進行觀察，對照組為沒有和MPC蛋白溶液混合的難溶性鈣的水分散液。

1.3.3 鈣增強劑的ζ-電位分析 將制得的鈣增強劑重新分散在超純水中（質量分數0.05%），用超聲波處理使其盡可能分散均勻。用馬爾文ZetasizerNano-ZS對再分散液進行ζ-電位的檢測，采用Smoluchowski模型近似處理[10-11]。

1.3.4 鈣增強劑的表面蛋白質量濃度分析 CaCO3吸附蛋白質（初始質量濃度＜1 mg/mL）后，在純水中再分散，用Lowry法[12-13]分析離心所得的上清液。HA和TCP吸附蛋白后，在純水中再分散，用Biuret法[14-15]分析離心所得的上清液。檢測樣品為離心后所得上清液和漂洗沉淀所得漂洗液的混合液，被吸附到鈣鹽上的蛋白量為混合液中蛋白含量與初始蛋白含量的差值。通過被吸附的蛋白量與鈣鹽顆粒的總表面積可以計算得到表面蛋白質量濃度。所有實驗至少平行兩次。

1.3.5 鈣增強劑的表面蛋白組分分析 通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）[16-17]對離心所得的樣品的上清液進行研究，分析MPC中不同的蛋白組分與難溶性鈣表面相互作用的差異性，上樣量為20 μL，分離膠的質量濃度為12 g/dL，濃縮膠的質量濃度為4 g/dL，用考馬斯亮藍R-250溶液對膠板染色，脫色處理后通過凝膠成像儀及Image Lab 3.0軟件定量分析各蛋白條帶亮度。不同實驗條件下，上清液中的殘余蛋白的差異以上清液中的蛋白余量與初始蛋白總量的比值表示，至少平行兩次。

1.3.6 鈣增強劑對MPC熱穩定性的影響 實驗對4組不同的鈣鹽樣品進行研究，包括：（1）新型鈣增強劑；（2）難溶性鈣：碳酸鈣、羥基磷灰石和磷酸三鈣；（3）可溶性鈣鹽：氯化鈣和乳酸鈣；（4）空白組：不添加鈣的蛋白溶液。

進行3種不同質量濃度鈣鹽的添加，考察不同鈣鹽對乳蛋白熱穩定性的影響。將3組鈣鹽樣品分別加入到20 mL，10 mg/mL的蛋白質溶液中，用0.1 mol/L的NaOH或HCl對各個樣品進行pH值的調節，使得pH值為7.0±0.1，每一個樣品都充分攪拌，均勻混合。取6 mL樣品于玻璃試管中，編號后用相機拍照記錄。另外，將所有樣品放入80℃的恒溫水浴鍋中加熱15 min。水浴加熱后，再一次觀察每一根試管中蛋白質的表觀變化，并用相機拍照記錄。

1.3.7 鈣增強劑的懸浮穩定性 分別考察了鈣增強劑在純水體系和蛋白溶液中的懸浮穩定性。

1）鈣增強劑在純水體系的懸浮穩定性：將鈣增強劑重新分散到超純水中，超聲處理使其分散均勻，以900 nm波長作為入射光，記錄120 min內再分散液的濁度的變化[18-19]，至少平行兩次。通過（1）式得到溶液吸光度值隨時間的減少率：

吸光度值減少率（%）=（At/A0）×100% （1）

At為t時間再分散液的吸光度值，A0為起始吸光度值。

2）蛋白溶液中的穩定性：實驗組將在5 mg/mL MPC溶液中制備得到的難溶鈣-蛋白復合物添加到相應5 mg/mL MPC溶液中，對照組為難溶性鈣本身添加到5 mg/mL MPC溶液中，混合后靜置10 h拍照。

2 結果與討論

2.1 鈣增強劑的表面形貌觀察

通過激光共聚焦顯微鏡成像（CLSM）觀察制備得到的鈣增強劑的表面形貌。采用FITC染色對蛋白進行染色（FITC不能對鈣鹽染色）[20]。圖1是染色后的鈣增強劑的CLSM圖像，在黑色的、近似球狀的中心（鈣鹽顆粒）表面存在綠色圓環（染色后的蛋白層），表明制備得到的鈣增強劑是一種鈣劑吸附蛋白后的復合物。

2.2 鈣增強劑的ζ-電位分析

ζ-電位是表征膠體或懸浮物體系穩定性的重要指標，也常用來分析帶電粒子之間的靜電相互作用。圖2顯示了不同的鈣劑和MPC復合后，顆粒ζ-電位的變化。

圖2（a）顯示CaCO3在水中帶正電荷，當與MPC混合后，CaCO3的ζ-電位突躍為負值，ζ-電位的變化與混合時初始蛋白質質量濃度變化相關。隨著混合時初始蛋白質質量濃度的增加，離心后再分散液的ζ-電位的絕對值逐漸增加；當蛋白質質量濃度增大到一定程度后，ζ-電位絕對值不再有明顯變化，吸附蛋白后CaCO3的ζ-電位開始達到平衡峰值，此時初始MPC質量濃度約為0.5 mg/mL。在該實驗條件下，MPC自身帶負電荷，CaCO3的ζ-電位從正值突變為負值并且絕對值隨蛋白質質量濃度增加而增加，這說明蛋白質已經吸附到鈣鹽顆粒表面，形成了復合物；ζ-電位達到最大值，則說明CaCO3對MPC的吸附達到了飽和。

圖2（b）和2（c）分別為HA和TCP的ζ-電位隨初始蛋白濃度的變化情況。HA和TCP在水中略帶負電荷，與MPC的混合反應后，HA和TCP再分散液的ζ-電位的絕對值與圖2（a）中CaCO3的ζ-電位變化一致，也是隨著混合時初始蛋白質質量濃度的增加逐漸增大，直到達到吸附飽和，ζ-電位不再變化。使HA和TCP開始達到飽和吸附的初始MPC質量濃度均為5 mg/mL左右。

2.3 pH值對鈣增強劑表面蛋白量的影響

圖3所示為3種難溶性鈣對MPC吸附量隨pH值的變化。由于CaCO3在pH接近6時已發生部分溶解，所以該增強劑的pH討論范圍為pH 7~9，而HA和TCP的討論范圍為pH 6~8。

實驗中，3種難溶性鈣對MPC的吸附量隨著初始溶液pH值的增加而減少。這是由于當pH降低時，CaCO3上的碳酸根離子以及HA和TCP上的磷酸根離子質子化，它們的負電荷減少，因此帶負電荷的蛋白與鈣鹽上帶負電荷的基團之間靜電排斥力減小，更多的蛋白能夠吸附在鈣鹽的Ca2+位點上。

此外，比較圖3（b）和3（c）后發現同屬于磷酸鈣類的HA和TCP吸附MPC的量不同。3種鈣劑平均粒徑d50經激光粒度分析儀測定得到：CaCO3為1.3 μm；羥基磷灰石為2.1 μm；TCP為1.9 μm。通過BET比表面積檢測法得到CaCO3比表面積為13.8 m2/g；羥基磷灰石比表面積為88.6 m2/g；TCP的比表面積為67.2 m2/g。當溶液pH值相同時，雖然TCP的比表面積略小于HA，但是TCP能夠吸附比HA更多的MPC。不同的磷酸鈣晶體結構可能造成吸附蛋白質的差異性。郭靈虹[21]研究建立的HA和TCP的晶胞模型認為，HA和TCP晶胞中中Ca與磷酸基團的距離不同，HA中比較小。因此，從晶體結構上分析，兩種磷酸鈣的Ca和磷酸基團的反應活性不同，HA的反應活性可能比較小。另外，HA晶胞單位面積內Ca和O的數目明顯小于TCP中的數目[21]，這也會造成兩種鈣增強劑表面蛋白質含量的差異。

2.4 MPC中不同的蛋白組分與不同鈣劑相互作用的差異性分析

圖4所示為MPC與不同鈣劑旋轉培養后的上清液中蛋白組分的SDS-PAGE凝膠電泳圖及相應的α-酪蛋白和β-酪蛋白條帶的定量分析。

從圖4可以看出，MPC中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白在不同鈣劑上的吸附優勢始終保持為β-乳球蛋白>α-乳白蛋白。MPC中α-酪蛋白和β-酪蛋白在不同鈣劑上的吸附優先性則表現為β-酪蛋白>α-酪蛋白。在MPC中，乳清蛋白以單體或較小的4級結構存在，而酪蛋白是以較大的膠態聚合體形式存在，即酪蛋白膠束。研究[20，22]指出，當HA顆粒加入脫脂乳中會造成酪蛋白膠束的解離，隨后以單一酪蛋白形式（α-酪蛋白和β-酪蛋白）結合到顆粒表面。這種酪蛋白膠束的裂解是因為乳清中存在的鈣離子，磷酸根離子和可能存在的檸檬酸根離子結合到HA顆粒表面上，從而打破了MPC中的礦物平衡[22]，使得酪蛋白膠束內部的膠體磷酸鈣進入溶液，酪蛋白膠束裂解。在鈣鹽吸附MPC時，單體酪蛋白需要經過酪蛋白膠束的裂解而釋放，而乳清蛋白則可直接被吸附到顆粒表面，特別是電荷集中分布的β-乳球蛋白。膠束裂解后，已有部分的β-乳球蛋白占據了鈣鹽顆粒的吸附位點，此時，鈣鹽顆粒都帶上了更多的負電荷，在隨后α-酪蛋白和β-酪蛋白的吸附過程中，β-酪蛋白比α-酪蛋白所帶的凈負電荷略少，另外β-酪蛋白電荷集中分布的優勢也占據了主導，這就使得MPC中酪蛋白在3種鈣鹽上的吸附優先性都為β-酪蛋白>α-酪蛋白。

為了更好地全面了解這種吸附優先性的相互作用機制，仍需要對這些蛋白質中的單一組分與不同鈣鹽的相互作用進行深入的研究探討，因為其他些因素也會對蛋白質和鈣鹽顆粒之間的相互作用產生影響，包括顆粒的性質（如表面組成和結構）以及發生吸附后可能產生的蛋白質與蛋白質、蛋白質與顆粒之間的協同相互作用等[23-26]。

2.5 鈣增強劑對MPC熱穩定性的影響

根據我國GB 14880-2012《食品營養強化劑使用衛生標準》中規定鈣強化的調制乳粉中，鈣的使用量為3.0~7.2 g/kg，其中可以使用的鈣劑有碳酸鈣、葡萄糖酸鈣、檸檬酸鈣、乳酸鈣、氯化鈣、乙酸鈣、氧化鈣、甘氨酸鈣、磷酸三鈣等。這些外源性鈣強化劑，可歸于分子鈣和離子鈣兩類，市場上的高鈣乳制品通常采用分子鈣。通過實驗比較了不同鈣劑對牛乳蛋白熱穩定性的影響，包括鈣增強劑、分子鈣和離子鈣。

水浴前各樣品差異不明顯，但加熱后，添加可溶性鈣的MPC出現了明顯的絮凝沉淀。MPC中既有酪蛋白，也有乳清蛋白，以4∶1的比例存在于其中。與酪蛋白酸鈉中的酪蛋白不同的是，MPC中的酪蛋白是以膠束形式存在的，膠束的外表覆蓋著κ-酪蛋白“毛發層”，起到穩定膠束結構的作用。與其他種類的酪蛋白相比，κ-酪蛋白的磷酸化程度最低，對鈣離子最不敏感。有研究表明，高溫短時的巴氏殺菌（72℃，15 s）處理對酪蛋白膠束結構幾乎沒有影響，但是更高的處理溫度會造成乳清蛋白變性，使得乳清蛋白通過巰基-二硫鍵交換反應與酪蛋白膠束發生作用，特別是β-乳球蛋白和κ-酪蛋白間的相互作用[27]。因此，Ca2+的存在一方面促進了β-乳蛋白的熱變性以及其與κ-酪蛋白的二硫鍵交聯，另一方面降低了酪蛋白膠束的靜電排斥作用，并在酪蛋白分子間形成鈣橋，從而導致了絮凝。

通過鈣增強劑、分子鈣和離子鈣對牛乳蛋白熱穩定性影響的比較，顯示了作者制備的鈣增強劑，不會對乳蛋白的熱穩定造成不良的影響，可以作為強化劑添加到牛乳蛋白中。

2.6 鈣增強劑的懸浮穩定性考察

2.6.1 鈣增強劑在純水相中的懸浮穩定性 圖5為鈣增強劑的懸浮液吸光度隨時間的變化情況。達到吸附飽和以后，MPC對HA和TCP懸浮液分散穩定性的改善效果明顯優于對CaCO3分散穩定性的改善效果。對CaCO3來說穩定性由原先的~10%提高到~40%，對HA和TCP來說，穩定性由~10%提高為~60%。從懸浮液在室溫下靜置10 h后的照片，可以明顯看出鈣增強劑懸浮穩定性的改善效果。另外在圖6中觀察到了少量MPC的吸附對3種鈣鹽懸浮液穩定性的負作用，即吸附少量MPC后，顆粒的懸浮液穩定性相比沒有蛋白吸附的鈣鹽本身（對照組樣品）更低，這說明鈣增強劑制備時的蛋白溶液需要達到一定的濃度。

通過鈣增強劑和難溶性鈣在水相中懸浮液分散穩定性的對比說明鈣增強劑的懸浮穩定性得到了提高。

2.6.2 鈣增強劑在MPC蛋白溶液中的懸浮穩定性難溶性鈣或鈣增強劑添加到MPC蛋白溶液中，分散液的懸浮穩定性在靜置10 h后進行對比，鈣增強劑分散在蛋白溶液中時，其分散穩定性更好，10 h后大部分的純鈣鹽已經沉降到了小瓶底部，而大部分的復合物仍然分散在蛋白溶液中。

3 結語

基于難溶性鈣和食源性蛋白制備了一種復合物，可作為新型鈣增強劑使用。通過CLSM觀測其形貌，并通過ζ-電位、溶液濁度等考察了鈣增強劑的懸浮穩定性，結果表明其在純水分散液和蛋白溶液中的分散穩定性都有所提高。與傳統的難溶性鈣鹽相比，新型鈣增強劑能改善產品的穩定性，可被應用于速溶型高鈣乳粉的生產，也可用于其他蛋白液態、蛋白粉體或蛋白棒等高鈣蛋白制品的生產中。

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Preparation and Suspension Stability of a New Calcium-Fortifier

HU Jinhua1，4， LU Jiping1， WEN Lijie1， ZHOU Yue1， ZHOU Peng*1，2，3
（1.State Key Laboratory of Food Science&Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；4.State Key Laboratory of Molecular Engineering of Polymers，Fudan University，Shanghai 200433，China）

A new calcium-fortifier（Ca-MPC）prepared from milk protein concentration（MPC）powders and insoluble calcium salts was characterized by confocal laser scanning microscopes and ζ-potential.It was confirmed as the complex of protein and calcium particles.The formation of Ca-MPC was driven by the weak molecular interactions.The differential interaction between protein and calcium particles was further investigated.An improvement on the suspension stability of Ca-MPC was observed when dispersed either in DI-water or protein solution，implying the industrial application as a good resource of calcium-fortifier.

milk protein concentration，calcium carbonate，hydroxyapatite，tricalcium phosphate，molecular interaction

TS 201

A

1673—1689（2016）11—1174—08

2015-02-01

江蘇省自然科學基金項目（BK20150150）；教育部留學回國人員科研啟動基金項目（1024130201150130）；江南大學食品科學與技術國家重點實驗室自由探索課題（SKLF-ZZB-201602）；聚合物分子工程教育部重點實驗室（復旦大學）開放課題基金項目（K2015-20）。

胡錦華（1982—），女，江蘇無錫人，工學博士，副教授，主要從事食品科學研究。E-mail：hujinhua@jiangnan.edu.cn

*通信作者：周 鵬（1975—），男，山東青島人，哲學博士，教授，博士研究生導師，主要從事食品科學研究。E-mail：zhoupeng@jiangnan.edu.cn