蛤蜊醬的發酵工藝及其鮮味物質分析

周 敏， 錢建瑛， 余永健， 李永仙， 李 崎*

（1.江南大學 教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 釀酒科學與工程研究室，江蘇無錫214122；3.江南大學 藥學院，江蘇 無錫214122；4.江蘇恒順醋業股份有限公司，江蘇 鎮江212028）

麥麩醬中的氨基氮質量分數高于其他兩種工藝條件下發酵制得的蛤蜊醬，這可能是由于添加麥麩制曲，使得原料顆粒更小，與種曲接觸面更大，產酶更充分。因此，選擇添加麥麩的成曲與蛤蜊共同發酵蛤蜊醬工藝。

2.3 蛤蜊醬游離氨基酸分析

蛤蜊具有高蛋白低脂肪的特點，在發酵中，蛤蜊中的蛋白質可以被微生物產生的酶降解，利用高效液相分析蛤蜊麥麩醬，蛤蜊面醬及調配后蛤蜊醬的游離氨基酸質量分數，分析結果如表2所示。

蛤蜊醬的發酵工藝及其鮮味物質分析

周 敏1，2， 錢建瑛3， 余永健4， 李永仙1，2， 李 崎*1，2

（1.江南大學 教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 釀酒科學與工程研究室，江蘇無錫214122；3.江南大學 藥學院，江蘇 無錫214122；4.江蘇恒順醋業股份有限公司，江蘇 鎮江212028）

為綜合利用我國蛤蜊資源，研究蛤蜊醬的發酵生產。以米曲霉為發酵微生物，比較了不同原料制曲和不同發酵工藝對蛤蜊醬中氨基氮和氨基酸含量的影響，結果顯示：以麥麩制曲和發酵初期加入蛤蜊的工藝最佳，其總氨基氮質量分數最高，為1.25 g/hg；其谷氨酸為1.2 g/hg；呈味核苷酸為209.54 mg/hg。發酵結束后蛤蜊醬鮮味突出，其中5'-GMP的呈味強度值為8.460，說明發酵過程中產生的5'-GMP對蛤蜊醬鮮味有重要貢獻。

鮮味；蛤蜊醬；氨基酸；核苷酸

蛤蜊是一種雙殼類軟體動物，分為花蛤、文蛤、青蛤等諸多品種，其肉質細嫩，味道鮮美，具有“天下第一鮮”、“百味之冠”等美譽[1-3]。蛤蜊軟體含粗蛋白質10.5%~12.6%[4]，可以通過發酵使其分解，形成海鮮風味突出的調味品[5]。除呈味氨基酸外，軟體中富含的核酸類物質也可以在發酵過程中分解為5’-單磷酸肌苷二鈉（IMP）、5’-單磷酸鳥苷二鈉（GMP）和5’-單磷酸腺苷二鈉（AMP）等呈味核苷酸[6]，這些核苷酸與谷氨酸單鈉MSG、天冬氨酸單鈉可以產生協同效應，形成更強烈的鮮味。

鮮蛤蜊肉不宜長時間保存，目前仍以鮮食為主。近年來開始有蛤蜊加工產品出現，如文蛤餅、凍蛤蜊肉串[6]等產品，均是采用常規工藝加工的產品，其肉質老，并失去了原有的鮮美風味。近來，也有利用文蛤為主要原料進行酶解，加工成水解蛋白產品[4，6]，由于大都采用單一酶進行水解，存在原料降解不完全、產品風味單一等缺陷，若通過微生物發酵可在一定程度上彌補酶解的不足。米曲霉可以產生多種蛋白酶，此外還有酯酶、核酸酶、糖化酶，淀粉酶及纖維素酶等酶類，利用其復雜的生物酶系，可以使原料中所含的大分子物質得到充分降解，形成易被人體吸收的氨基酸、葡萄糖、脂肪酸等小分子物質以及風味氨基酸和風味核苷酸等鮮味成分，從而提高蛤蜊產品的品質[7-8]。目前市場的海鮮醬大多采用調配工藝，采用微生物發酵制備蛤蜊醬尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 蛤蜊肉：江蘇省如東縣生態文蛤養殖基地提供；米曲霉滬釀3.042、麥麩、面粉、豆粉、食鹽：市售。

5’-單磷酸肌苷二鈉標準品、5’-單磷酸鳥苷二鈉標準品和5’-單磷酸腺苷二鈉標準品：Sigma公司產品。

1.1.2 實驗儀器 Agilent1100氨基酸專用高效液相色譜儀：美國Agilent公司產品；MJ-25BM06A高速搗碎機：廣東美的電器制造有限公司產品；磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司產品；HHS型熱恒溫水浴鍋：上海博訊事業有限公司產品；UV-2000分光光度計：UNICO （上海）儀器有限公司產品；KjeltecTM 8200凱式定氮儀：福斯分析儀器公司產品；SPX-250型恒溫恒濕培養箱：上海躍進有限公司產品。

1.2 試驗方法

蛤蜊醬發酵工藝流程如下所示：

其中紅色字體和黑色字體部分，命名為工藝1，即麩曲培養，其原料配比為：m（取麥麩）∶m（豆粉）∶m（水）=2∶1∶5質量配比混勻；藍色字體和黑色字體部分流程命名為工藝2，即面曲培養，其原料配比為：m（面粉）∶m（豆粉）∶m（水）=2∶1∶5的質量比混勻；紫色字體和黑色字體部分流程命名為工藝3，即肉曲培養，其原料配比為：取m（蛤蜊肉）∶m（面粉）∶m（水）= 1∶3∶5的比例混勻[4]。

1.2.1 菌種活化 從菌種保藏斜面中挑取1~2環的米曲霉孢子接種到PDA斜面培養基中[8]，并于28℃恒溫培養箱中培養3~4 d，至斜面長出黃綠色孢子。

1.2.2 種曲培養 取麩皮8 g，豆粕2 g，水8 mL混勻于250 mL三角瓶中，于121℃，0.1 MPa下滅菌15 min制得種曲培養基，將斜面培養基培養的菌種孢子接種于種曲培養基，置于培養箱中28℃培養48 h。

1.2.3 成曲培養 成曲培養分為麩曲培養、面曲培養和肉曲培養[9]。分別將3個工藝的曲料置于高壓蒸汽滅菌鍋中于0.1 MPa、121℃下滅菌15 min。以米曲霉為發酵微生物，拌以干面粉接種，接種量為0.5%，并用干凈的6層濕紗布（121℃、20 min滅菌）覆蓋曲料，最后置于28℃恒溫恒濕培養箱中培養48 h，使米曲霉充分產酶。成曲制備好后，取成曲與面粉按1∶1的質量比混勻壓實，放入培養箱中使溫度上升至44~50℃。

1.2.4 原料預處理 選用優質蛤蜊肉，用清水清洗3-5遍去除泥沙，于沸水中燙煮10 min，去除蛤蜊肉腥味并使其蛋白質適度變性，取出蛤蜊肉粉碎備用，肉湯則需混入食鹽調配成食鹽水，待發酵時使用。

1.2.5 發酵蛤蜊醬的制作方法 取經過預處理的蛤蜊肉100 g兩份，取工藝1和工藝2成曲各500 g，向工藝1和工藝2成曲中各加入鹽質量分數為12%的肉湯500 g混勻；另取工藝3成曲500 g，并向成曲中加入鹽質量分數為12%的肉湯500 g混勻。將各工藝條件下的原料轉移到40℃恒溫培養箱中發酵28 d，滅菌后與加熱的食用油和香料調配，充分攪拌，制得口感鮮美，香氣協調的蛤蜊醬。

1.2.6 成曲酶活測定 采用SB/T 10317-1999測定[10]。在波長680 nm條件下，酪氨酸質量濃度在0~100 μg/mL范圍內，其回歸方程為y=0.010 4x+0.000 8，R2=0.999，線性關系良好，k=96.077，結果見圖1。

1.2.7 游離氨基酸測定 取醬醅2 g于燒杯中加入體積分數5%的三氯乙酸 （TCA）50 mL勻漿，靜置1~2 h，2層濾紙過濾，以10 000 r/min離心10 min，使用0.45 μL濾膜過濾到進樣瓶中備用[10-11]。

色譜條件：D 4.0 mm×125 mm C18柱，流量1.0 mL/min，柱溫 40℃，檢測波長 338 nm，262 nm（Pro），流動相A為20 mmol/L醋酸鈉，流動相B為20 mmol/L，V（醋酸鈉）∶V（甲醇）∶V（乙腈）=1∶2∶2。

1.2.8 核苷酸測定 稱取醬醅10 g，加入20 mL體積分數5%冷的高氯酸勻漿2 min，超聲處理5 min。然后4 000 r/min離心5 min。取上清轉入100 mL容量瓶中，得到的沉淀物用體積分數5%高氯酸再浸提，超聲處理，離心操作2次，合并上清液定容，使用0.45 μm濾膜過濾到進樣瓶中備用。

儀器及色譜條件：采用Diamonsil C18色譜柱（D 4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為0.05 mol/L的磷酸二氫鉀溶液，流速為1.0 mL/min，柱溫30℃，紫外檢測器檢測波長為254 nm，進樣量10 μL，等度洗脫20 min[12]。

1.2.9 氨基態氮、總酸及食鹽測定 分別采用GB/ T5009.40-2003中的硝酸銀滴定法、酸堿滴定法及甲醛值法[13]。

1.2.10 菌落總數，大腸菌群及致病菌的測定 采用GB 4789.22-2003測定[14]。

2 結果與討論

2.1 成曲酶活的測定

利用米曲霉產生的酶系中主要是中性蛋白酶，因此本研究以中性蛋白酶酶活力為指標。由于3種工藝制得成曲的原料配比不同，在制曲過程中，微生物產酶能力也不同，測得不同成曲中中性蛋白酶酶活如表1所示。

由表1可看出，在3種工藝下得到的成曲酶活分別是3 140.91、2 286.58、1 672.94 U/g。在同樣的培養條件下，工藝1的麩曲酶活力最高。造成工藝1中酶活力高于工藝2的原因在于：加水之后，面粉更容易黏成塊狀，導致供氧不足，影響了米曲霉的生長和產酶，而加入適當比例的麥麩可以改善原料的疏松性和供氧狀況。工藝3中蛋白酶活最低，可能由于米曲霉不能直接利用動物蛋白充分產酶，從而酶活力較低，此外，夏季溫度較高，直接利用蛤蜊肉制曲易使肉曲染菌，產生明顯的酸臭味。

2.2 蛤蜊醬在發酵過程中氨基氮變化分析

隨著發酵的進行，蛤蜊醬中的氨基氮不斷積累，不同處理條件下的蛤蜊醬中氨基氮質量分數變化見2圖所示。

從圖2可看出，在發酵初期，蛤蜊醬中的氨基氮質量分數迅速增加，隨著發酵進行到后期，氨基氮質量分數增加緩慢，趨于平衡。發酵結束后，工藝1中蛤蜊麥麩醬的氨基氮質量分數為1.25 g/hg，工藝2中蛤蜊面醬的氨基氮質量分數為1.19 g/hg，工藝3中蛤蜊醬的氨基氮質量分數為0.96 g/hg，蛤蜊

麥麩醬中的氨基氮質量分數高于其他兩種工藝條件下發酵制得的蛤蜊醬，這可能是由于添加麥麩制曲，使得原料顆粒更小，與種曲接觸面更大，產酶更充分。因此，選擇添加麥麩的成曲與蛤蜊共同發酵蛤蜊醬工藝。

2.3 蛤蜊醬游離氨基酸分析

蛤蜊具有高蛋白低脂肪的特點，在發酵中，蛤蜊中的蛋白質可以被微生物產生的酶降解，利用高效液相分析蛤蜊麥麩醬，蛤蜊面醬及調配后蛤蜊醬的游離氨基酸質量分數，分析結果如表2所示。

從表2中可看出，采用工藝1發酵的蛤蜊醬游離氨基酸質量分數為4.9 g/hg，其中必需氨基酸質量分數為1.6 g/hg，谷氨酸質量分數為1.2 g/hg；工藝2發酵的蛤蜊醬游離氨基酸質量分數為3.8 g/ hg，其中必需氨基酸質量分數為1.52 g/hg，谷氨酸質量分數為0.48 g/hg；工藝3發酵制得的蛤蜊醬的游離氨基酸總質量分數為2.84 g/hg，必需氨基酸質量分數為1.2 g/hg，谷氨酸質量分數為0.31 g/hg。谷氨酸是主要呈鮮味的氨基酸，由于工藝2和工藝3制得的成曲所產酶活力相對較低，在后期發酵時，對蛤肉降解不完全，所以其游離氨基酸質量分數較低。工藝1制得的蛤蜊醬中氨基酸質量分數最高，說明其蛋白質降解最充分，使醬品更易吸收。此外，工藝1中谷氨酸質量分數遠高于工藝2和工藝3，這大大提高了蛤蜊醬中的鮮味。因此，作者選擇工藝1制曲發酵蛤蜊醬。

作者檢測了4種市售海鮮醬中游離氨基酸質量分數，如圖3所示，4種市售海鮮醬中的氨基酸質量分數均低于蛤蜊麥麩醬，經微生物發酵，醬品中的蛋白質可以得到更充分的降解，從而制得營養均衡的產品。此外，市售樣品多添加了鮮味劑以提高海鮮醬的鮮味，市售樣品1、2中谷氨酸質量分數較高，分別為2.69 g/hg和2.05 g/hg，但市售樣品1、2中其余氨基酸含量遠遠低于蛤蜊麥麩醬，營養價值低。

2.4 蛤蜊醬核苷酸分析

甲殼綱魚類的肌肉中，90%以上的核苷酸是嘌呤的衍生物，還有少量的尿嘧啶和胞嘧啶存在，在活體中，ATP為主要的存在形式，海鮮貝類死后ATP則通過下列途徑被降解[15]：

檢測工藝1發酵結束后蛤蜊醬中AMP、IMP和GMP的含量。配制一定濃度的標準樣品溶液，采用1.2.7中的色譜工作條件，得到3種呈味核苷酸標準樣品的HPLC圖譜，結果見圖4。

根據方法1.2.7對醬醅中的呈味核苷酸進行提取和測定，得到醬醅中呈味核苷酸HPLC圖譜，見圖5。

呈味核苷酸對鮮味的貢獻取決于其呈味強度值（taste activity value，TAV），即呈味物質在樣品中的含量與該化合物的呈味閾值之比。若呈味物質TAV大于1，則說明該物質對滋味有重要貢獻[16-17]。醬醅中3種呈味核苷酸質量分數及其呈味強度值見表4。蛤蜊醬中呈味核苷酸總質量分數為209.54 mg/hg，其中5’-GMP的質量分數最高 （105.8 mg/ hg），其次是5’-AMP（17.89 mg/hg）、5’-IMP（3.790 mg/hg）。5’-GMP可能是由于在發酵過程中核酸降解積累獲得。從呈味強度值來看，5’-AMP、5’-GMP、5’-IMP的呈味強度分別為 0.4400、8.460、0.1500，明顯高于蛤蜊肌肉中呈味核苷酸的質量分數[16]，5’-GMP的TAV遠大于1，蛤蜊醬中5’-GMP其鮮味有重要貢獻。

2.5 蛤蜊醬微生物指標分析

對蛤蜊醬的微生物指標進行檢測，蛤蜊麥麩醬菌落總數及大腸菌群均在合理范圍內，且未檢出致病菌，符合微生物標準。

3 結語

在蛤蜊醬發酵過程中，醬醅中氨基氮質量分數先增加后趨于平緩。工藝1制得的蛤蜊醬中氨基酸尤其是谷氨酸質量分數明顯高于工藝2和工藝3，大大提高了蛤蜊醬的海鮮風味。蛤蜊醬中氨基酸總質量分數高于市售海鮮醬，在保證蛤蜊醬原始鮮味的前提下，具有更高的營養價值。

工藝1制得的蛤蜊醬中呈味核苷酸總質量分數為209.54 mg/hg。其5’-GMP可能是由于在發酵過程中核酸降解積累獲得。從呈味強度值來看，5’-GMP的呈味強度值為8.460，說明蛤蜊醬中5’-GMP對鮮味有重要貢獻。經微生物指標分析，蛤蜊醬中各項微生物指標均符合國家標準。

上述實驗結果表明，工藝1發酵制得的蛤蜊醬中理化指標最佳，其風味典型，鮮味突出，可提升蛤蜊的附加值。

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科技信息

歐盟擬批準L(+)乳酸作為活性物質用于生物殺滅劑產品類型1

2016年9月16日，歐委會發布G/TBT/EU/406號通報,頒布委員會執行法規草案，擬批準將L(+)乳酸作為活性物質用于生物殺滅劑產品類型1。該通報的評議截止日期為通報發布后60天，批準日期為2016年12月，生效日期為歐盟官方公報發布后20天。

［信息來源］廈門WTO工作站.歐盟擬批準L(+)乳酸作為活性物質用于生物殺滅劑產品類型1[EB/OL].(2016-9-19). http://www.xmtbt-sps.gov.cn/detail.asp?id=52548

Fermentation Technology of Clam Sauce and Umami Substances Analysis

ZHOU Min1，2， QIAN Jianying3， YU Yongjian4， LI Yongxian1，2， LI Qi*1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Laboratory of Brewing Science and Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.School of Medicine，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；4.Heng Shun Vinegar Co.，Ltd of Jiang Su，Zhengjiang 212028，China）

The fermentation of clam sauce was studied to development of clam resource utilization. The contents of amino nitrogen and amino acid were investigated based on the different raw materials and fermentation technologies，in which Aspergillus oryzae was used as the fermentation microorganism.The optimization of fermentation condition was achieved by koji made from wheat bran and clam added in the initial stage.The total content of amino nitrogen was as high as 1.25 g/100 g with 1.2 g/100 g of glutamic acid and 209.54 mg/100 g of flavor nucleotide.A characteristic flavor of clam sauce was significantly exhibited with the 5'-GMP intensity of 8.460.The contribution of 5'-GMP to umami flavor of clam sauce during fermentation was confirmed.

umami，clam sauce，amino acids，nucleotide

TS 264

A

1673—1689（2016）11—1195—06

2015-01-13

國家海洋局海洋公益性行業科研專項（201305007）。

*通信作者：李 崎（1971—），女，上海人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事啤酒釀造科學研究。E-mail：liqi@jiangnan.edu.cn