干細(xì)胞結(jié)合生物材料治療脊髓損傷的研究進(jìn)展

陳 剛 吳 駿 于天飛

(1 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院 161006； 2 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所干細(xì)胞與生殖生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100101)

脊髓屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在腦的調(diào)控下控制大部分運(yùn)動(dòng)功能傳導(dǎo)和簡(jiǎn)單反射。脊髓損傷(spinal cord injure, SCI)是指外力破壞脊柱造成的組織損傷，一般會(huì)導(dǎo)致患者癱瘓，給家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。

1 脊髓損傷概述

SCI分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。而根據(jù)不同的時(shí)間又可以分為5個(gè)不同階段：①即刻期(immediate phase)：傷后0～2 h；②早急性期(early acute phase)： 傷后2～48 h；③亞急性期(subacute phase)： 傷后2 d到2周；④中間期(intermediate phase)：傷后2周到6個(gè)月；⑤慢性期(chronic phase)： 傷后6個(gè)月以上[1]。但是，臨床上一般將受傷后的前4～5周稱為急性期。

整個(gè)SCI過程也可以簡(jiǎn)略概括為前、中、后3期：①前期：傷處脊髓組織受損，神經(jīng)元壞死，缺血缺氧誘發(fā)神經(jīng)元凋亡；②中期：急慢性炎癥反應(yīng)，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、髓鞘包被軸突大量減少；③后期：脊髓萎縮產(chǎn)生囊泡空穴，星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，并浸潤(rùn)損傷的白質(zhì)和灰質(zhì)區(qū)域形成疤痕組織[1]。

目前，常規(guī)的SCI處理辦法有藥物治療，外科手術(shù)和康復(fù)治療，但沒有可以治愈的方法。

2 干細(xì)胞結(jié)合生物材料治療脊髓損傷

當(dāng)前基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)是干細(xì)胞移植治療SCI。干細(xì)胞(stem cells)是一類具有自我更新、并在一定條件下可分化為多種組織細(xì)胞的多潛能細(xì)胞，理論上可以在體內(nèi)分化并替代病變丟失或死亡的細(xì)胞類型，從而達(dá)到治病的目的。為了使更多的細(xì)胞滯留在病灶，研究者通常會(huì)采用生物材料作為細(xì)胞移植的支架，提供支撐和營(yíng)養(yǎng)作用。

選擇材料時(shí)應(yīng)考慮以下因素：①生物相容性：包括無毒、無免疫原性等；②物理性質(zhì)：包括材料的機(jī)械強(qiáng)度、孔隙大小和內(nèi)部通道等；③化學(xué)性質(zhì)：包括可降解性、消毒方式和表面分子構(gòu)造對(duì)細(xì)胞的影響等；④均一性：包括可規(guī)模化制造，無批次個(gè)體差異及可商品化等。

目前，干細(xì)胞結(jié)合生物材料治療脊髓損傷所用材料很多，其中主要種類及其特點(diǎn)和研究進(jìn)展敘述如下：

2.1 膠原 膠原(collagen)是細(xì)胞外基質(zhì)中含量最多的蛋白，是細(xì)胞支架的主要組成部分。膠原有可降解、無毒副作用等特性，可以與干細(xì)胞分化再生優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，是SCI細(xì)胞移植治療的良好載體。

中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所戴建武研究組對(duì)利用膠原材料治療SCI進(jìn)行了10多年的研究，在大鼠和比格犬上取得了一系列令人振奮的成果。他們發(fā)現(xiàn)，膠原材料可作為神經(jīng)祖細(xì)胞(neural progenitor cells，NPCs)的支架，并促使其在體內(nèi)向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分化[2]。

Zaminy等[3]誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)分化獲得施旺細(xì)胞(Schwann cells，SCs)，然后將其接種至膠原材料上進(jìn)行移植，移植后進(jìn)行的免疫組化染色和行為學(xué)評(píng)價(jià)均表明，材料結(jié)合細(xì)胞的療效優(yōu)于單獨(dú)材料組和對(duì)照組。

Yuan等[4]將新鮮豬肌腱切碎、純化，再分別在-25℃和-80℃凍干獲得內(nèi)外孔徑不同的雙層膠原膜支架(double-layer collagen membranes scaffold)。該材料內(nèi)部孔道直徑為100 μm，可為神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)、分化提供良好的環(huán)境；外部孔道直徑小于10 μm，可通過各種營(yíng)養(yǎng)因子，同時(shí)可防止外周細(xì)胞入侵。

2.2 殼聚糖 殼聚糖(chitosan)是甲殼素脫N-乙酰基的衍生物，是一種無毒、可降解的高分子多糖。

Jian等[5]設(shè)計(jì)并合成了殼聚糖、細(xì)胞外基質(zhì)與SB216763的混合材料，該材料可以提高神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)體外分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的效率。在半切SCI模型大鼠移植實(shí)驗(yàn)中，材料組的電生理和運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分(Basso, Beattie, Bresnahan Locomotor Rating Scale，BBB Scale)顯著優(yōu)于對(duì)照組。

研究表明，三維殼聚糖支架可以使腦損傷模型小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)[6]，殼聚糖混合聚乳酸合成新型三維材料支架(PLA/CS)也能促進(jìn)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化[7]。另有研究報(bào)道，單獨(dú)的殼聚糖緩釋神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或者僅材料就能促進(jìn)SCI后組織重建和功能恢復(fù)，但更多的是使用殼聚糖結(jié)合各種類型細(xì)胞和(或)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子治療SCI[8]。

2.3 層連蛋白 層連蛋白(laminin)是細(xì)胞外基質(zhì)中一種黏附性糖蛋白，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，是實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用的一種細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)膠。

Menezes等[9]利用人脂肪來源的基質(zhì)細(xì)胞對(duì)SCI模型大鼠進(jìn)行細(xì)胞移植治療，發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞極大地促進(jìn)了組織保留、軸突再生和功能恢復(fù)，進(jìn)一步的機(jī)制研究顯示移植處有大量的層連蛋白沉積，有利于該蛋白提供較強(qiáng)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)保護(hù)作用。層連蛋白還可使血管再生和抗細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)外促進(jìn)神經(jīng)分化、微管聚合和神經(jīng)再生。

Amr等[10]利用層連蛋白處理殼聚糖作為類神經(jīng)干細(xì)胞的支架，對(duì)慢性SCI患者進(jìn)行材料細(xì)胞移植治療，并根據(jù)美國(guó)脊髓損傷協(xié)會(huì)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(The ASIA impairment scale，A-E逐漸恢復(fù))對(duì)患者運(yùn)動(dòng)能力、肌肉活動(dòng)和感覺功能的恢復(fù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示運(yùn)動(dòng)評(píng)分最少改善兩個(gè)等級(jí)，感覺評(píng)分最少改善三個(gè)等級(jí)。上述研究表明層連蛋白不論是基礎(chǔ)科研還是臨床應(yīng)用都有極強(qiáng)的價(jià)值。

2.4 海藻酸鹽 海藻酸鹽(alginate)是褐藻細(xì)胞壁中的一種酸性多糖，通常被加工成海藻酸鈉作為黏合劑、穩(wěn)定劑使用。

浙江大學(xué)城市學(xué)院的史晨悅等[11]用固態(tài)、液態(tài)高壓滅菌方法制備了不同濃度的海藻酸鈉，發(fā)現(xiàn)10%固態(tài)高壓滅菌海藻酸鈉培養(yǎng)原代小鼠 (BMSCs) 時(shí)細(xì)胞活性最高，同時(shí)其在體內(nèi)可顯著促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)絲生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)能力恢復(fù)。藻酸鈣可減少損傷引起的脫髓鞘反應(yīng)和纖維化疤痕，緩釋神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或再結(jié)合細(xì)胞可以引導(dǎo)軸突方向性生長(zhǎng)并在病灶整合，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

Erdogan等[12]用藻酸膠包被分離獲得大鼠臍帶血細(xì)胞后移植到SCI模型大鼠T8-T9半切損傷處，術(shù)后21 d改良Tarlov評(píng)分(1～5，分?jǐn)?shù)越高恢復(fù)越好)結(jié)果顯示移植組恢復(fù)至4.2分，相應(yīng)對(duì)照組僅1.2分。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)移植組的脊髓損傷處死亡細(xì)胞少，軸突生長(zhǎng)多。

蘭州綜合醫(yī)院的汪大彬等[13]用凍干法得到殼聚糖-藻酸鹽支架材料，接種BMSCs后移植治療急性SCI模型大鼠，術(shù)后6周BBB評(píng)分結(jié)果顯示，材料細(xì)胞組(14.40±1.43)顯著高于單獨(dú)細(xì)胞組(8.40±1.07)、單獨(dú)材料組(10.20±0.92)和對(duì)照組(6.40±0.97)。這些研究說明藻朊酸鹽材料對(duì)脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)有很大的促進(jìn)作用。

2.5 其他 材料除了作為支架，還有其他作用。例如改善病灶微環(huán)境，減少炎癥反應(yīng)和促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)、血管再生等。在支架材料上聯(lián)合多種成分變得越來越流行，包括多種營(yíng)養(yǎng)因子、不同種類細(xì)胞結(jié)合等，這些方法也用積極的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明其對(duì)SCI的潛在治療價(jià)值，包括軸突再生、疤痕組織減少和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)等。

Qiu等[14]使用三維海綿膠(gelatin sponge)接種過表達(dá)原肌球蛋白受體激酶C(trkC)或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白3(NT-3)的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)對(duì)T10橫斷模型大鼠進(jìn)行移植治療，后期進(jìn)行了詳細(xì)的檢驗(yàn)，在電生理、組織切片、免疫熒光染色、行為學(xué)等多個(gè)方面均顯示，海綿膠結(jié)合細(xì)胞的治療效果十分優(yōu)異。Li等[15]的研究驗(yàn)證了NT-3和海綿膠聯(lián)合使用對(duì)SCI治療的促進(jìn)作用，這些實(shí)驗(yàn)都表明神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子結(jié)合材料對(duì)SCI的微環(huán)境產(chǎn)生了積極的影響，證明材料加因子治療SCI很有前景。其他研究表明纖連蛋白(fibronectin)[16]、結(jié)冷膠(gellam gum)[17]和瓊脂糖(agarose)[18]也是良好的細(xì)胞支架材料。

3 總結(jié)與展望

脊髓具有獨(dú)特而又復(fù)雜的微環(huán)境，使功能重建變得非常困難。單純的細(xì)胞移植治療SCI存在很多不足，包括無法克服病灶的神經(jīng)抑制微環(huán)境、無法支持移植細(xì)胞存活、無法刺激軸突再生和重新髓鞘化等。因此，細(xì)胞結(jié)合材料或營(yíng)養(yǎng)因子，可以取長(zhǎng)補(bǔ)短協(xié)同作用，是未來SCI的治療研究趨勢(shì)。生物材料加工處理也十分重要，包括材料親疏水性、制備時(shí)控制空隙大小、材料表面粗糙程度等。根據(jù)結(jié)合因子或細(xì)胞的特性，需要將工藝優(yōu)化。戴建武等[19]對(duì)膠原材料特殊設(shè)計(jì)加工，導(dǎo)入腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)結(jié)合位點(diǎn)，保證BDNF能特異性結(jié)合到材料上而不被迅速釋放或清除。生物材料移植到體內(nèi)后，根據(jù)自身特性會(huì)在一定時(shí)間內(nèi)降解。例如Yang等[20]實(shí)驗(yàn)中所用的殼聚糖移植到大鼠體內(nèi)約30 d就會(huì)降解消失。除了本文中的天然生物材料，大量的聚合材料也被用于研究。這些材料與生物材料相比各有優(yōu)缺點(diǎn)，臨床可根據(jù)不同案例進(jìn)行選擇。