PLGA及PLGA-PEG-PLGA水凝膠的制備

劉 迪,黃曉英,何旭敏,林 旭*,夏海平*(.廈門大學化學化工學院,福建廈門36005;.廈門普瑞安生物科技有限公司,福建廈門36000)

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PLGA及PLGA-PEG-PLGA水凝膠的制備

劉 迪1,黃曉英2,何旭敏1,林 旭2*,夏海平1*
(1.廈門大學化學化工學院,福建廈門361005;2.廈門普瑞安生物科技有限公司,福建廈門361000)

摘要:本研究通過控制反應操作條件,優化了聚乳酸乙醇酸(PLGA)的合成工藝,縮短了制備時間,并能通過控制反應時間制備預期相對分子質量的PLGA;同時優化后的處理工藝,降低了溶劑殘留毒害等級.還將不同相對分子質量PLGA(Mn≥2 000)與系列相對分子質量聚乙二醇(PEG)共聚,合成具有溶液-凝膠轉換特性的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物,得到對應組成搭配規律,測出了相應水凝膠特性相圖.

關鍵詞:聚乳酸乙醇酸(PLGA);聚乙二醇(PEG);優化;PLGA-PEG-PLGA;三嵌段共聚物;水凝膠

聚乳酸乙醇酸(PLGA)是乳酸(LA)與乙醇酸(GA)經聚合反應而成的共聚物,是一種重要的生物降解材料,具有無毒、良好的生物相容性等特點,在藥物傳輸、基因治療、醫用纖維材料等領域得到越來越廣泛的應用[1-5];且已獲美國食品藥品管理局(FDA)認證,被正式作為藥用輔料收錄進美國藥典.

在國內外已報道的PLGA制備方法中,開環聚合法、溶液聚合法及固相聚合法,均有各自的缺點[6-10].相對而言,熔融聚合法因具有簡單易行、毒害性小等優點,近年來已逐漸被采用[11-13].但是,熔融聚合法存在著制備時間長、合成成本較高等問題,亟待解決.目前,采用熔融聚合法可控地制備出不同相對分子質量PLGA的研究尚未見報道.本文通過控制反應條件,優化PLGA熔融聚合工藝,不僅縮短了PLGA合成時間,而且得到通過調控反應時間制備各相對分子質量PLGA的規律.并在后處理工藝中:使用毒害等級較低的丙酮取代三氯甲烷作為提純溶劑,降低溶劑殘留毒害等級;確定真空干燥過程的操作參數,解決溶劑殘留問題.

在PLGA應用中,PLGA與聚乙二醇(PEG)聚合形成的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物作為當今生物高分子水凝膠材料研究熱點受到廣泛關注[14-16].已報道的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物水凝膠制備研究中,主要考察的是較小相對分子質量PLGA(n≤1 600)與較小相對分子質量PEG(n≤1 500)的共聚,而且是以固定相對分子質量PEG為中心,共聚接上PLGA[17-18].本文考察了以不同相對分子質量PLGA(n≥2 000)為研究主體,用系列相對分子質量PEG(n≥2 000)與之進行共聚,得到可以形成水凝膠的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物,并得出PLGA與PEG不同相對分子質量的搭配規律;進而測出各搭配合成的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物水溶液相圖,得到相應溶液-凝膠轉變范圍.此項研究可為藥物載體緩釋應用提供依據.

1 實驗部分

1.1試 劑

L-LA,85%～90%水溶液;GA,98%白色固體粉末;PEG(PEG2000、PEG6000、PEG8000、PEG10000、PEG20000),以上均為分析純,阿拉丁試劑(上海)有限公司;SnCl2·2H2O,98%無色顆粒,優級純,安耐吉化學(上海)有限公司;甲基磺酸(MSA),99%微棕色油狀液體,優級純,安耐吉化學(上海)有限公司.上述百分數均為質量分數.

1.2儀 器

傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR):Nicolet Avatar 330,美國熱電公司;核磁共振波譜儀(NMR):Avance Ⅲ400 MHz,瑞士Bruker公司;凝膠滲透色譜(GPC):Waters 1515,美國Waters公司,色譜柱(StyragelRHT,3根,流動相為四氫呋喃(THF),有效相對分子質量范圍分別為500～20 000,5 000～ 60 000,50 000～4 000 000);紫外-可見分光光度計(UV-Vis):UV-2100,日本島津公司;同步熱分析儀(SDT):SDT Q600,美國TA儀器公司;智能釋放試驗儀:ZRS-8GD,天津市天大天發科技有限公司.

1.3PLGA的合成優化

制備預期相對分子質量PLGA:按摩爾比1∶1稱取一定量的L-LA和GA加入到100 m L三口燒瓶中,加熱進行磁力攪拌.抽取真空,在140℃、4 k Pa下,除水1 h;加入催化劑SnCl2·2 H2O(終質量分數0.5%),提高反應溫度至165℃,并在1 h內逐漸抽取真空至400 Pa;保持165℃不變,調節壓力為70 Pa,在該條件下反應若干小時.

短時間制備較大相對分子質量PLGA:在上述165℃、400 Pa下反應2 h后,加入催化劑MSA(終質量分數0.3%),提高反應溫度至175℃,繼續抽取真空至70 Pa,反應2 h.

后處理:經過合成得到預期PLGA粗產物后,需要進行提純工藝:將反應產物先溶解在良性溶劑中,再在PLGA非良性溶劑中沉淀,得到較為純凈的PLGA產品.Wang等[19]、Lan等[20]在制備PLGA的后處理中,均使用三氯甲烷溶解反應產物.三氯甲烷被美國FDA列為第2類應限制溶劑,考慮到PLGA在醫藥工程領域的應用[1-5],從健康和安全性角度對后處理工藝進行優化很有必要.研究表明,丙酮是合成PLGA反應產物的良性溶劑,且丙酮為第3類低毒性溶劑,所以,本文用丙酮代替三氯甲烷作為提純工藝的溶解溶劑.將上述2種合成方法制備的PLGA粗產物,在真空中冷卻至常溫,加入一定量丙酮攪拌溶解,并在無水乙醚中沉淀,去除上清液后用一定量丙酮溶解,再于無水乙醚中沉淀,反復3次;然后在110℃、2 k Pa下真空干燥11 h,得到PLGA產品.

1.4大分子PLGA-PEG-PLGA合成

按摩爾比2∶1稱取已知相對分子質量PLGA和相應相對分子質量PEG,加入到50 m L三口燒瓶中,在常壓下通入氮氣,磁力攪拌下加熱至160℃,反應8 h.得到不同相對分子質量匹配下的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物粗產品,氮氣氛圍下冷卻至室溫,用一定量冷水溶解,加溫至75℃沉淀,去除上清液,再用冷水溶解,加熱至75℃沉淀,反復3次.再于-18℃下冷凍3～4 h,35℃真空干燥,得到純凈的PLGAPEG-PLGA三嵌段共聚物.

1.5PLGA-PEG-PLGA水溶液制備

將上述每種PLGA-PEG-PLGA置于帶蓋玻璃試管中,用2～4℃的去離子水分別配制質量分數為10%,15%,25%,35%,45%的水溶液,保存在2～4℃冰箱中,待測.

1.6表征測試

1.6.1PLGA表征

FT-IR表征:溴化鉀壓片法;NMR表征:氘代三氯甲烷(CDCl3)或氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)為溶劑,400 MHz;GPC測試:以THF為溶劑,聚苯乙烯為標樣,柱溫35℃,流速1 m L/min.

1.6.2PLGA-PEG-PLGA三嵌段聚合物表征

SDT測定:氮氣氛圍,升溫速率為10℃/min,升溫范圍為20～300℃.

溶液-凝膠轉變相圖測試:試管倒置法.將冷藏的不同質量分數PLGA-PEG-PLGA水溶液于水浴中加熱,從20℃以2℃/步的速率梯度升溫至76℃,各溫度點恒溫15 min,然后將試管倒置30 s,觀察試管中水溶液現象.若試管倒置中水溶液沒有流下,則判定為水溶液轉變為凝膠態,記錄該溫度及在該溫度下發生溶液-凝膠轉變的相應水溶液質量分數,繪制溶液-凝膠轉變相圖.

2 結果與討論

2.1優化制備的PLGA表征

2.1.1FT-IR譜圖檢測分析

圖1所示為L-LA與GA物理混合樣、優化制備的PLGA以及購買參比樣PLGA的FT-IR譜圖.圖中1 732 cm-1歸屬于L-LA與GA物理混合樣中L-LA 與GA羧基的羰基(—CO)吸收峰,1 756 cm-1歸屬于PLGA中酯基的羰基(—CO)吸收峰.產物中1 756 cm-1吸收峰的出現,表明L-LA和GA的羧基、羥基發生了反應.對比優化制備的PLGA與購買參比樣PLGA的FT-IR譜圖,其特征峰及指紋區一致,表明優化制備的PLGA是合格的.

優化制備PLGA過程中,不同反應時間得到的PLGA、優化條件短時間制備的PLGA與參比樣的紅外譜圖特征峰及指紋區均一致.與圖1中相同,測得的系列譜圖中,1 756 cm-1吸收峰為L-LA和GA中羧基、羥基反應生成酯基的羰基(—CO)吸收峰,說明優化條件制備的PLGA品質可靠.

圖1　L-LA與GA物理混合樣(a)、參比樣PLGA(b)及制備的PLGA(c)的FT-IR譜圖Fig.1 Infrared spectra of mixed sample L-LA+GA(a), standard sample PLGA(b)and maded PLGA(c)

2.1.2NMR譜圖檢測分析

PLGA制備后處理工藝未優化之前,以三氯甲烷作為制備PLGA后處理溶劑,得到的PLGA產品中殘留有三氯甲烷,如圖2譜線a,1H-NMR譜圖中化學位移δ=8.32處為三氯甲烷雜質峰;用丙酮替代三氯甲烷作為后處理溶劑,在常溫真空干燥條件下,得到的PLGA產品中也會殘留有丙酮,如圖2譜線b,1HNMR譜圖中化學位移δ=2.09處為丙酮雜質峰;經過實驗探究,得到經提純、沉淀后的PLGA產品在110℃、2 k Pa真空干燥11 h后,不會再存在溶劑雜質,如圖2譜線c,1H-NMR譜圖上沒有出現δ=2.09處丙酮溶劑峰,表明該制備后處理條件可以解決溶劑殘留問題.

2.1.3GPC檢測分析

表1是不同反應時間下得到的PLGA的GPC測試結果.結果表明,隨著反應時間的增加,PLGA的相對分子質量逐漸上升,這與羧基和羥基縮聚反應過程機理是一致的.隨著反應的進行,羧基和羥基不斷反應,合成的PLGA鏈不斷增長,其相對分子質量也不斷增加.因此,可以通過控制反應時間得到不同相對分子質量的PLGA,實現PLGA相對分子質量的可控化.

在此基礎上,加入催化劑MSA(質量分數0.3%),提高反應溫度至175℃,繼續抽取真空至70 Pa,反應只需要2 h就可以得到較大相對分子質量PLGA(n=20 000)產物,與已有報道的反應時間(≥15 h)[10-13]相比,極大地縮短了反應時間.

圖2　制備工藝優化后處理PLGA產品的1H-NMR譜圖(400 MHz,DMSO-d6)Fig.21H-NMR spectra(400 MHz,DMSO-d6)of post-processing PLGA product preparation technology optimization

2.2PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物表征

2.2.1SDT法表征嵌段結構

將合成的不同相對分子質量的PLGA-PEGPLGA三嵌段共聚物分別進行熱重分析(TGA),得到的圖形基本一致(如圖3).結果表明,合成的共聚物有明顯的雙峰,分別在299.3和377.9℃.TGA曲線出現雙峰,可以判定為2種情況:檢測共聚物是嵌段共聚物或接枝共聚物,而由PLGA與PEG反應化學結構來看,形成的共聚物不可能得到接枝結構,則可以判斷形成的PLGA-PEG-PLGA為嵌段共聚物.

2.2.2NMR表征三嵌段結構

測得PEG及PEG與PLGA共聚產物的1H-NMR譜圖如圖4.譜線a中,δ=2.45處為PEG兩端羥基氫(—OH)的峰;PLGA與PEG共聚產物中,出現了PEG與PLGA反應產生的酯基,其旁邊的亞甲基質峰位于譜線b中δ=4.25處,同時未出現PEG兩端羥基峰.證實了PEG與PLGA共聚產物中PEG兩端的羥基均與PLGA進行了酯化反應,形成了PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物.

2.2.3水溶液的溶液-凝膠轉變特性測試

通過試管倒置法,可以觀測PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物水溶液的凝膠化過程,以及在凝膠化過程中存在的狀態.結果表明,對于n≥2 000的PLGA,與之搭配合成PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物水溶液,在溫度變化中能夠凝膠化的PEG相對分子質量有一定規律,即PEG相對分子質量應為PLGA相對分子質量的3～4倍,如n=2 000的PLGA,只有用PEG6000～PEG8000與之搭配合成的PLGAPEG-PLGA三嵌段聚合物水溶液才能出現溶液-凝膠轉化的現象.不同相對分子質量的PLGA與PEG搭配及溶液-凝膠轉變情況見表2.

PLGA的相對分子量大小直接影響該共聚物在水介質中的降解速率,較小的PLGA所制備的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物在水介質中降解較慢,如n<2 000的PLGA與PEG合成的PLGAPEG-PLGA三嵌段共聚物水解時間過慢(1個月)[21],影響載藥釋放效果.本文研究的n≥2 000 PLGA與PEG合成的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物,根據表2中PLGA與PEG相對分子質量的搭配規律,可控地制備特定相對分子質量的PLGAPEG-PLGA,使得到的藥物輔料具有臨床所需的藥物緩釋周期.

表1　不同反應時間PLGA產品的GPC測試結果Tab.1 GPC results of PLGA in different reaction time

圖3　PLGA-PEG-PLGA的TGA曲線Fig.3 TGA of PLGA-PEG-PLGA copolymers

圖4　PEG(a)及PEG與PLGA共聚產物(b) 的1H-NMR譜圖(400 MHz,CDCl3)Fig.41H-NMR spectra(400 MHz,CDCl3)of PEG(a) and copolymerization product of PEG with PLGA(b)

表2　不同相對分子質量PLGA與PEG搭配及溶液-凝膠轉變情況Tab.2 Allocation and results of different molecular weight PLGA matching with PEG

2.2.4相圖繪制

根據該相圖規律,可控制相應水凝膠在載藥使用中,在較低溫度即溶液態下配制藥劑,而在凝膠區溫度時施用藥劑,使之呈凝膠態,便于操作.

3 結 論

本研究通過調控熔融聚合制備PLGA工藝中的操作條件,對PLGA制備工藝進行了優化,確定了在短時間內得到較大相對分子質量PLGA的操作條件,通過控制反應時間,制備預期大小的相對分子質量PLGA,優化了制備后處理工藝,為PLGA制備提供直接指導.

圖5　不同相對分子質量組成的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物水溶液相圖Fig.5 Phase diagram of different molecular weight of PLGA-PEG-PLGA

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Preparation of PLGA and PLGA-PEG-PLGA Hydrogels

LIU Di1,HUANG Xiaoying2,HE Xumin1,LIN Xu2*,XIA Haiping1*
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Xiamen University, Xiamen 361005,China;2.Amoy PURUIAN Biotech Co.Ltd.,Xiamen 361000,China)

Abstract:In this study,an optimized process of poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)preparation was reported,including shorting synthetic time to obtain PLGA with expected molecular weight,by controlling the reaction conditions of operation.An optimized process of its post-treatment was also investigated,reducing the residue-level of toxic organic solvent.Furthermore,this study was focused on co-polymerization of PLGA(n≥2 000)and polyethylene glycol(PEG)to form PLGA-PEG-PLGA triblock copolymers. The solution-gel conversion properties were characterized by their phase diagrams of the corresponding PLGA-PEG-PLGA aqueous solution.

Key words:PLGA;PEG;optimization;PLGA-PEG-PLGA;triblock copolymers;hydrogel

*通信作者:hpxia@xmu.edu.cn(夏海平);kevinlin1916@gmail.com(林旭)

收稿日期:2015-06-08 錄用日期:2015-07-30

doi:10.6043/j.issn.0438-0479.2016.02.003

中圖分類號:O 631

文獻標志碼:A

文章編號:0438-0479(2016)02-0162-06

引文格式:劉迪,黃曉英,何旭敏,等.PLGA及PLGA-PEG-PLGA水凝膠的制備[J].廈門大學學報(自然科學版),2016,55(2): 162-167.

Citation:LIU D,HUANG X Y,HE X M,et al.Preparation of PLGA and PLGA-PEG-PLGA hydrogels[J].Journal of Xiamen U-niversity(Natural Science),2016,55(2):162-167.(in Chinese)