綠色化學方法合成兒茶酚-殼聚糖水凝膠的應用

陳 曦,俞明珠,劉 劍,楊 柳,韓守法(廈門大學化學化工學院,福建廈門361005)

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綠色化學方法合成兒茶酚-殼聚糖水凝膠的應用

陳 曦,俞明珠,劉 劍,楊 柳*,韓守法*
(廈門大學化學化工學院,福建廈門361005)

摘要:水凝膠在生物醫學領域有重要應用價值,如促進傷口愈合等.利用殼聚糖與2,4,5-三羥基苯甲醛或2,3,4-三羥基苯甲醛通過一步環境友好、副產物為水的生成希夫(Schiff)堿的反應,得到一類殼聚糖-兒茶酚類的水凝膠應用于傷口處理.2,4,5-三羥基苯甲醛修飾的殼聚糖水凝膠(CC-1)能有效抑制金黃色葡萄球菌生長,而2,3,4-三羥基苯甲醛修飾的殼聚糖水凝膠(CC-2)具有極強的黏附性.在小鼠模型上,CC-1促進開放性傷口愈合的效果與商品化藥膏(DuoDERM)相當.與文獻報道的以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亞胺(EDC)縮合法合成的水凝膠相比,本研究在制備CC-1或CC-2的過程中不需要加入額外的化學試劑,終產物只有水凝膠和水,無需純化,安全無毒,即配即用.

關鍵詞:殼聚糖;兒茶酚;水凝膠;生物黏附

傷口的愈合過程經歷4個階段:急性炎癥期、細胞增殖期、瘢痕形成期、表皮及其他組織再生期[1].在傷口愈合過程中,成纖維細胞大量增殖,在傷口底部及邊緣生長出肉芽組織,通過分泌膠原蛋白和纖維連接蛋白來促進傷口的收縮[2-3].傷口中的血液和滲出液中的纖維蛋白原很快凝固形成凝塊,有的凝塊表面干燥形成痂皮,起著保護傷口的作用[4].已有研究表明,水凝膠因其物理狀態及其含水量高的特性成為促進傷口愈合的理想型生物材料,不僅有助于吸收傷口組織的滲出液,還可以防止傷口因蒸發和脫水產生水分損失,從而為促進傷口愈合提供了一個理想的環境[5-6].雖然水凝膠被認為是傷口處理的理想材料,但是目前所發展的水凝膠有諸多問題,如機械強度差、溶解性不佳及細胞毒性高等,限制了它的應用發展[7-9].

殼聚糖生物相容性高,可生物降解,具有止血和抗感染等特性[10-11],且可以刺激巨噬細胞產生生長因子,產生傷口愈合所需的外環境[12-13],促進成纖維細胞的增殖,從而使傷口加速愈合;然而在p H中性的水溶液中溶解度很差,這在一定程度上限制了它的應用[2,14-17].目前提高殼聚糖水溶性的方法都有一些局限性:降低殼聚糖的分子質量可以有效提高它的溶解性[18-19],但是會導致殼聚糖某些特性的喪失[20];另有研究報道[21-23],通過化學修飾可提高殼聚糖溶解性,主要是針對殼聚糖氨基這個反應位點進行化學修飾,通過接入親水性基團如聚乙二醇(PEG),修飾過PEG的殼聚糖在水中的溶解性確實得到了很大的改善,但是由于PEG的空間位阻較大,會掩蓋殼聚糖的一些活性位點,使殼聚糖失去一些固有特性,如抑菌性.

海洋軟體動物海虹(mussel)能夠表達一類具有強烈黏附性的蛋白,該類蛋白含有一種特殊的氨基酸(3,4-dihydroxytyrosine)[24],它能夠使得海虹在海水中緊緊吸附在巖石、木頭、輪船底部等不同的地方[25].有文獻報道,將這類鄰苯二酚(兒茶酚)類化合物修飾在殼聚糖上,能極大地增加殼聚糖的水溶性[26].與大分子(如PEG)修飾的區別是:兒茶酚類化合物體積小,可以降低其空間位阻效應,不阻擋殼聚糖與細胞或細菌的結合位點;更重要的是,由于兒茶酚類化合物所特有的黏附性,能使修飾后的殼聚糖形成水凝膠[27].目前多數文獻報道,將兒茶酚類化合物修飾到高分子材料上主要是通過1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基二亞胺(EDC)縮合法[27-28],但該反應時間較長,且反應結束后需要對材料進行純化.

基于水凝膠在生物醫學領域的重要應用價值(如促進傷口愈合)及殼聚糖本身所特有的止血與抑菌作用,本文利用殼聚糖與兒茶酚類衍生物(2,4,5-三羥基苯甲醛或2,3,4-三羥基苯甲醛)通過一步環境友好、副產物為水的生成希夫(Schiff)堿的反應,得到一類可用于傷口處理的殼聚糖-兒茶酚類的水凝膠.與基于EDC縮合法合成的水凝膠相比,我們在制備的過程中不需要加入額外的化學試劑,終產物只有水凝膠和水,無需純化,安全無毒,即配即用.

1 實驗部分

1.1試 劑

殼聚糖(Sigma試劑公司),2,3,4-三羥基苯甲醛(Keddia試劑公司),2,4,5-三羥基苯甲醛(TCI試劑公司),醋酸(CH3COOH)和二甲基亞砜(DMSO)(國藥集團化學試劑有限公司),胰酶、小牛血清、雙抗、Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)高糖培養基和噻唑藍(MTT)(Hyclone公司),蛋白胨、酵母提取物和瓊脂(BIO BASIC公司),所有試劑均為分析純,未經特殊說明均未經過特別處理;金黃色葡萄球菌和Hela細胞為ATCC公司提供;測試所用水均為超純水(18.2 MΩ·cm).

1.2儀 器

傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀:Nicolet Avatar 360;核磁共振(NMR)儀:Bruker AV 400;拉力測試儀: Instron 3343;酶標儀(吸光度分析):SpectraMax M5.

1.3材料的合成

稱取10.0 g殼聚糖置于50 m L圓底燒瓶中,然后向反應瓶中加入含有0.3%(體積分數)醋酸的水溶液10 m L,攪拌使殼聚糖充分溶解,再向反應瓶中分別加入33.33 mg的2,4,5-三羥基苯甲醛和2,3,4-三羥基苯甲醛,反應體系在室溫(RT)下攪拌1 h,反應完成得到淡黃色黏稠液體,即為產物2,4,5-三羥基苯甲醛-殼聚糖(CC-1)和2,3,4-三羥基苯甲醛-殼聚糖(CC-2)(圖1).

1.4分析測試

FT-IR表征:使用Nicolet Avatar 360 FT-IR儀.

NMR表征:使用Bruker AV400 NMR儀,以氘水(D2O)為溶劑,四甲基硅烷(TMS)為內標進行NMR一維氫譜(1H-NMR)表征.

黏接強度的測定:使用Instron 3343拉力測試儀,被黏材料為新鮮豬皮,黏接區域約為25 mm×25 mm(以實際黏接面積為準),涂膠厚度約為0.5 mm.

細胞毒性實驗(MTT實驗):HeLa細胞用DMEM高糖培養液進行培養,其中加入10%(體積分數)的牛胎血清(FBS)和1% (體積分數)的抗生素(青霉素和鏈霉素各100 U/m L).將細胞消化后分別分到96孔板中,過夜培養后分別用小分子2,3,4-三羥基苯甲醛及2,4,5-三羥基苯甲醛培養48 h.接著用0.25 mg/m L的MTT孵育細胞4 h以生成藍紫色結晶甲臜,輕輕吸去孔中液體后每孔用100μL DMSO溶解結晶物,震搖5 min后用Spectra Max M5酶標儀測定490 nm處的吸光度.

圖1　CC-1(a)和CC-2(b)的合成路線Fig.1 The synthetic process of CC-1(a)and CC-2(b)

抑菌實驗:金黃色葡萄球菌的單克隆體用Luria-Bertani(LB)液體培養基過夜培養后,離心收集菌體,稀釋至在600 nm處的吸光度為1;空白組為細菌在不加任何試劑的LB液體培養基培養8 h,3個對照組分別為細菌在含有殼聚糖、CC-1和CC-2的LB液體培養基培養8 h后,將菌液稀釋1×104倍,分別涂布在LB固體培養基上過夜培養.

小鼠實驗:取12只昆明白小鼠分為4組,每組3 只,在所有小鼠左側背部用打孔器(直徑1 cm)造傷口模型,傷口每日分別涂CC-1、CC-2、商品藥(DuoDERM,美國施貴寶公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS),觀察傷口愈合情況.

2 結果與討論

2.1反應物量比例的優化

為探索生成水凝膠時殼聚糖與2,4,5-三羥基苯甲醛或2,3,4-三羥基苯甲醛反應量的最合適比例,分別按質量比為6∶5,6∶4,6∶3.5,6∶3,6∶2.5,6∶2在上述條件中進行反應.如圖2(a)所示,以任一比例修飾的2,3,4-三羥基苯甲醛的殼聚糖在4 h后均形成水凝膠. 圖2(b)中,2,4,5-三羥基苯甲醛修飾的殼聚糖成膠速度較慢,在相同時間內只有質量比為6∶5和6∶4的成水凝膠狀,但過夜后,任一比例修飾的2,4,5-三羥基苯甲醛的殼聚糖均形成水凝膠.該課題設計的最終目的是希望將其用于傷口的處理,所以原則上希望該水凝膠含有盡可能多的殼聚糖且始終使其殼聚糖能有更多裸露的氨基使其帶正電(殼聚糖的正電性是其抑制細菌生長的原理[29]),因此我們選用質量比為6∶2來反應生成水凝膠CC-1和CC-2,后續實驗所用的水凝膠均以該比例合成得到.

2.2合成產物表征

2.2.1FT-IR表征

將合成的CC-1和CC-2凍干,使用溴化鉀壓片法進行FT-IR測定.圖3所示分別為CC-1和CC-2的譜圖.根據紅外光譜學的波峰分布,烯胺鍵在1 630～ 1 690 cm-1有較強吸收,CC-1和CC-2分別在1 650 cm-1和1 659 cm-1有吸收峰,因此可以初步斷定反應生成了殼聚糖水凝膠CC-1和CC-2.

2.2.2NMR表征

圖4(a)為殼聚糖的1H-NMR譜圖,圖4(b)和圖4(c)分別為所合成殼聚糖水凝膠CC-1和CC-2 的1H-NMR譜圖及其各質子的譜峰歸屬.圖4(b)中, δ=9.44左右的峰表示反應生成了烯胺鍵上的質子峰,δ=6.5～7.5的峰對應2,4,5-三羥基苯甲醛的苯環上的2個質子峰.圖4(c)中,δ=9.76左右的峰表示反應生成了烯胺鍵上的質子峰,δ=9.57左右的峰表示2,3,4-三羥基苯甲醛2位處的羥基與氮形成氫鍵的峰,說明所形成的殼聚糖水凝膠具有一定的穩定性;δ=6.5～7.5的峰對應2,3,4-三羥基苯甲醛的苯環上的2個氫和2個羥基氫的質子峰.通過1H-NMR譜圖分析,證明殼聚糖與2,4,5-三羥基苯甲醛和2,3,4-三羥基苯甲醛反應生成了殼聚糖水凝膠高分子.

圖2　反應物量比例的優化Fig.2 The optimization of amount of reactant proportion

圖3　CC-1和CC-2的FT-IR譜圖Fig.3 FT-IR spectra of CC-1 and CC-2

2.3黏附性實驗

將2塊一樣大小的豬皮(25 cm×40 cm),均勻涂抹上CC-2(10 mg/m L),厚約為0.5 mm,黏貼在一起4 h后測其拉力,最大值可達70 k Pa,證明CC-2具有一定的黏附性.根據相同的方法測CC-1的黏附力,發現其在4 h內不能將兩塊豬皮黏合到一起,黏合性能較差.由此可見,CC-1與CC-2中羥基位置的細微差別會導致二者在黏附性能上的巨大差異.

圖4　殼聚糖(a)及其水凝膠CC-1(b)和CC-2(c)的1H-NMR譜圖Fig.41H-NMR spectra of chitosan(a), CC-1(b)and CC-2(c)

2.4MTT實驗

殼聚糖水凝膠最終希望能夠用于對活體傷口的處理,因此對材料的毒性進行評估是必要的.將He La細胞在不同質量濃度(10,50,100μg/m L)的2,4,5-三羥基苯甲醛或2,3,4-三羥基苯甲醛中孵育48 h,用MTT實驗檢測細胞存活情況.如圖5(a)所示,2,4,5-三羥基苯甲醛與細胞的生物相容性好,即使在100 μg/m L的條件下細胞存活率也能達到65%,說明該分子沒有特別明顯的細胞毒性;如圖5(b)所示,2,3,4-三羥基苯甲醛毒性較大,在50μg/m L時,細胞存活率僅有30%.所以,由2,4,5-三羥基苯甲醛所修飾的殼聚糖水凝膠(CC-1)更適用于活體的傷口處理.

2.5對金黃色葡萄球菌的抑制作用

金黃色葡萄球菌是常見的容易引起傷口感染的

細菌,為考察CC-1和CC-2對其的抑制作用,將用LB液體培養基培養的金黃色葡萄球菌分為4組:空白組只加PBS,實驗組分別加入殼聚糖、CC-1和CC-2,終質量濃度為1 mg/m L.各組在37℃、220 r/min搖床搖菌8 h后,稀釋1×104倍涂板,在培養箱培養過夜.從圖7可以看出,CC-1組的細菌明顯少于其余3組,說明CC-1具有一定的抑制金黃色葡萄球菌生長的作用.

圖5　細胞毒性試驗Fig.5 Cytotoxicity test

圖6　在金黃色葡萄球菌的生長液中分別加入PBS(a)、殼聚糖(b)、CC-1(c)、CC-2(d)對其生長狀況的影響Fig.6 Influence of the growth of Staphylococcus aureus treated with PBS(a),chitosan(b),CC-1(c)and CC-2(d)

2.6活體實驗

為驗證水凝膠對傷口的愈合作用,創建了4組小鼠傷口模型.將4組小鼠的左側背部用打孔機各打出直徑1 cm的圓形傷口,之后每天分別在4組小鼠的傷口上涂抹CC-1、CC-2、商品藥(DuoDERM)以及PBS,觀察小鼠傷口愈合的的情況,并在0,3,7,14 d拍照.如圖7所示,涂抹CC-1的小鼠切口皮膚愈合與涂抹商品藥的小鼠皮膚愈合速度最快,涂抹PBS的對照組小鼠傷口愈合最慢.4組小鼠均沒有傷口感染的情況.實驗證明CC-1對傷口的治療具有較好的療效.

圖7　分別涂抹CC-1、CC-2、DuoDERM以及PBS的傷口圖片Fig.7 Photographs of wounds treated with CC-1,CC-2,DuoDERM and PBS

3 結 論

本文設計并合成了一類具有黏附性的兒茶酚類修飾的殼聚糖水凝膠CC-1和CC-2,可以用于傷口處理.2,3,4-三羥基苯甲醛或2,4,5-三羥基苯甲醛與殼聚糖上的氨基反應形成烯胺鍵,合成原料易得,僅需一步反應,反應時間快,且反應副產物僅有水,可以即配即用.CC-2具有較強黏附性;而CC-1對金黃色葡萄球菌的生長有一定抑制作用.在小鼠的傷口模型中,使用CC-1處理傷口與用商品化藥膏處理效果相當,證明CC-1對傷口有較好的治療作用.

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A Green and Mix-to-use Approach for Mussel Inspired Chitasan-Catechol Hydrogel

CHEN Xi,YU Mingzhu,LIU Jian,YANG Liu*,HAN Shoufa*
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Xiamen University,Xiamen 361005,China)

Abstract:Hydrogels have important applications in biomedical fields,such as promoting wound healing.Herein we tried to develop chitosan based adhesive hydrogels as tissue adhesives.We developed a green and mix-to-use approach for generation of mussel inspired chitasan-catechol hydrogel.An in situ gel-forming system composed of 2,4,5-three hydroxy benzaldehyde or 2,3,4-three hydroxy benzaldehyde conjugated chitosan derivatives was easily prepared,producing the hydrogels CC-1 and CC-2 respectively.In vitro study demonstrated that CC-1 could inhibit the growth of Staphylococcus aureus whereas CC-2 was a superior adhesive.In vivo wound healing study was performed by smearing hydrogels on rat dorsal wounds with a diameter of 10 mm and keeping them on for 14 days.Histological results demonstrated that CC-1 hydrogel was of high performance and comparable to commercialized wound dressing(DuoDERM)on wound healing.This approach is advantageous as no toxic byproducts are generated during making CC-1 and CC-2 hydrogels and only water is produced following formation of Schiff-base promoted hydrogels.The mix-to-use technique is of significance for commercial application.

Key words:chitosan;catechol;hydrogel;bioadhesive

*通信作者:shoufa@xmu.edu.cn(韓守法);liuyang@xmu.edu.cn(楊柳)

基金項目:國家自然科學基金(21305116);高等學校博士學科點專項科研基金(20130121120003);福建省自然科學基金(2014J01059, 2011J06004);湖南大學化學生物傳感與計量學國家重點實驗室基金(2012002)

收稿日期:2015-05-13 錄用日期:2015-08-19

doi:10.6043/j.issn.0438-0479.2016.02.006

中圖分類號:O 631.3

文獻標志碼:A

文章編號:0438-0479(2016)02-0178-06

引文格式:陳曦,俞明珠,劉劍,等.綠色化學方法合成兒茶酚-殼聚糖水凝膠的應用[J].廈門大學學報(自然科學版),2016,55 (2):178-183.

Citation:CHEN X,YU M Z,LIU J,et al.A green and mix-to-use approach for mussel inspired chitasan-catechol hydrogel[J]. Journal of Xiamen University(Natural Science),2016,55(2):178-183.(in Chinese)