金門高粱酒釀造副產物黃水的抗酪氨酸酶性質

陳志敏,崔 沂,張維友,胡泳華,王 勤,陳清西(廈門大學生命科學學院,濱海濕地生態系統教育部重點實驗室,福建廈門361102)

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金門高粱酒釀造副產物黃水的抗酪氨酸酶性質

陳志敏,崔 沂,張維友,胡泳華,王 勤,陳清西*
(廈門大學生命科學學院,濱海濕地生態系統教育部重點實驗室,福建廈門361102)

摘要:在金門高粱酒的釀造過程中,采用金選、兩糯、興湘、紅梗和紅糯5種高粱作為原料,收集得到副產物黃水,分析其成分.研究了5種黃水對蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制作用,其導致酶活力下降一半的抑制劑質量濃度分別為130,178, 104,301,230 ng/m L.5種黃水對蘑菇酪氨酸酶二酚酶均表現為可逆的抑制作用,其中金選、紅梗、紅糯的黃水表現為混合性抑制,兩糯和興湘的黃水表現為非競爭性抑制.探討了5種黃水對小鼠黑色素瘤細胞B16的細胞增殖率、酪氨酸酶活力和黑色素含量變化的影響.結果表明,100 mg/m L兩糯和興湘的黃水對酪氨酸酶活力的抑制效果較好,抑制率分別為52.7%和40.9%,黑色素含量的抑制率分別為44.5%和46.1%.綜上所述,黃水不僅對酪氨酸酶活力有很好的抑制作用,還可以很好地抑制黑色素生成,具有很好的應用前景.

關鍵詞:黃水;成分分析;酪氨酸酶;B16細胞

酒醅在發酵過程中,淀粉由糖變酒的同時產生CO2,單位酒醅的重量相對減少,結晶水游離出來,原料中的單寧、色素、可溶性淀粉、酵母自溶物、還原糖等溶于水中,并沉積于窖池底部而形成黃水[1-2].而黃水中含有豐富的有機酸、酒精,還有糖類和微生物菌體及活細胞等,黃水中的許多物質對提高白酒質量,增加白酒香氣,改善白酒風味有著重要的作用.

近年來,關于對黃水資源的再利用開展了大量研究,主要包括利用黃水釀醋[3],制備乙酸乙酯[4],以及利用黃水中的乳酸制備乳酸鈣、合成復合有機酸鈣[5]等.徐傳鴻等[6]對黃水進行常規的成分分析發現其中含有0.13%～ 0.23%的單寧,而Chai等[7]報道單寧物質具有抗酪氨酸酶的作用.我們對金門高粱酒釀造副產物黃水的成分進行了分析,同時探討了其對酪氨酸酶活力的抑制作用及對小鼠黑色素瘤細胞B16產生黑色素的影響.

1 材料與方法

1.1材 料

黃水收集自金門高粱酒釀造過程中產生的副產物;蘑菇酪氨酸酶(tyrosinase)、L-3,4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)均購自Sigma公司;其他試劑為國產分析純試劑;使用的蒸餾水為去離子重蒸水.

1.2方 法

1.2.1樣品制備

收集新鮮釀造黃水,25℃培養24 h;將可發酵物分解后,待酒精度不再增加,真空抽取以去除酒精; 0.45μm膜過濾后,真空濃縮,冷凍干燥待用.

1.2.2黃水的成分分析

淀粉及還原糖測定采用斐林試劑[8],蛋白質以總氮分析儀測定,總固形物采用質量測定法.用二甲基甲酰胺溶液振蕩提取單寧,過濾后取濾液,在氨存在的條件下,與檸檬酸鐵銨形成棕色絡合物,用分光光度計在525 nm處測定其吸光度值,與標準系列比較定量[9].取黃水200 m L,經蒸餾后,取100 m L以酒精計測定酒精.

1.2.3黃水對蘑菇酪氨酸酶活力的影響

參考文獻[10]方法,在磷酸鹽緩沖液(PBS,p H 6.8)中,以L-DOPA為底物測定酪氨酸酶二酚酶的活book=199,ebook=56力.先加入0.1 m L不同濃度的黃水于比色杯中,再加入2.8 m L預先30℃恒溫水浴的底物溶液(含PBS和L-DOPA),然后加入0.1 m L酪氨酸酶水溶液,即刻混勻;在30℃恒溫條件下檢測波長475 nm下的吸光度值(OD(475))隨時間的增長曲線,從曲線斜率計算出酶的活力,產物的消光系數以3 700 L/(mol·cm)計算.通過Lineweaver-Burk雙倒數作圖,比較酶催化反應的動力學參數,包括表觀米氏常數(Km)和最大反應速度(Vm)的變化,判斷抑制作用機理.

1.2.4黃水對小鼠黑色素瘤細胞B16的影響

參照文獻[11]的方法,采用RPMI1640培養基, 在37℃的CO2孵箱培養細胞.待細胞生長至近融合狀態,經胰蛋白酶消化收集并調整細胞濃度;在96孔細胞培養板中加入小鼠B16黑素瘤細胞的單細胞懸液,每孔180μL,培養過夜;待細胞完全貼壁后,加入20μL含黃水的培養液,繼續培養72 h,于結束前4 h棄培養液,用p H 7.4的PBS洗滌,加入10μL噻唑藍(MTT)和90μL RPMI1640培養液;在37℃的CO2孵箱培養細胞4 h后,棄上清液,加入200μL二甲亞砜(DMSO),在37℃條件下震蕩,使甲替結晶完全溶解,立即于酶標儀測定570 nm下的吸光度值(OD570),計算出細胞增殖率.

按上述相同的條件培養細胞,72 h后棄培養液, 用PBS洗滌,加入含1%(體積分數)Triton X-100的PBS 90μL;然后加入10μL 1.0 mg/m L L-DOPA,置于30℃反應30 min,測定OD475.相對酪氨酸酶剩余活力為:OD475/OD570×100%.

待細胞生長至近融合狀態,經胰蛋白酶消化收集并調整細胞濃度,接種過夜;待貼壁后換液,加入新鮮培養液和含不同濃度效應物的培養液,繼續培養72 h后棄培養液,用PBS洗滌;加入DMSO的NaOH溶液,80℃反應2 h,12 000 r/min離心10 min,上清液分別用于蛋白質濃度測定和405 nm處吸光度值(OD405)的測定,計算出黑色素含量.相對黑色素含量為:OD405/OD570×100%.

2 結 果

2.1黃水的常規成分分析

測定5種高粱在釀酒過程中產生的副產物黃水(YW1～YW5)的成分,包括p H值以及淀粉、蛋白質、總固形物、總氮、單寧、色素、還原糖、總糖和酒精的含量(質量濃度或質量分數),結果列于表1.從表中可見,5種黃水均呈酸性,在淀粉、蛋白質、總氮、還原糖含量方面差異不大,而單寧及色素含量有較大差異.

2.2黃水對蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力的影響

以L-DOPA為底物,測定5種黃水對酪氨酸酶二酚酶活力的影響.酪氨酸酶二酚酶的反應進程曲線斜率隨效應物的質量濃度(ρI)增大而下降,說明5種黃水均對二酚酶活力有抑制作用.由此得到5種黃水抑制酪氨酸酶二酚酶活力的濃度效應曲線(圖1),可得YW1～YW5導致酶活力下降一半的濃度(半抑制濃度,IC50)分別為130,178,104,301,230 ng/m L.

圖1　5種黃水對酪氨酸酶二酚酶活力的影響Fig.1 Effect of five types of yellow water on the diphenolase activity of tyrosinase

表1　5種高粱產生的黃水(YW1～YW5)的成分分析Tab.1 The component analyses of YW1-YW5

2.3黃水對蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力的抑制作用測定

固定底物L-DOPA濃度(ρS),改變反應體系中的酶量(質量濃度,ρE),測得的酶活力對酶量作圖,得到一組通過原點的直線(圖2).由圖可見隨著金選黃水(YW1)質量濃度的增大,直線斜率降低,說明YW1對酶的抑制作用屬于可逆過程,它是通過降低酶的催化效率導致酶活力的下降,而不是通過減少有效的酶量引起酶活力的下降.經測定,其他4種黃水對酪氨酸酶的抑制作用均屬于可逆抑制.

2.4黃水對蘑菇酪氨酸酶二酚酶活力的抑制作用類型

以Lineweaver-Burk雙倒數作圖法來判斷不同黃水對蘑菇酪氨酸酶的抑制作用類型,結果如圖3所示.圖3(a)為YW1的Lineweaver-Burk雙倒數圖,得到相交在第三象限的一組直線,由此說明隨著YW1質量濃度的增大,Km值和Vm值均變小,其抑制機理表現為混合Ⅱ型.以不同質量濃度YW1下測定的雙倒數圖直線的截距和斜率分別對YW1質量濃度作圖各為一條直線(圖3(a)插圖Ⅰ和Ⅱ),從直線的斜率可以求得抑制常數KI為196 ng/m L,酶-底物絡合物抑制常數KIS為89 ng/m L;同理可得其他4種黃水的Lineweaver-Burk雙倒數圖(圖3(b)～(e)),判斷得相應的抑制類型并計算得抑制常數(表2).

圖2　不同質量濃度金選黃水(YW1)對酪氨酸酶活力的影響Fig.2 Effect of different concentrations of YW1 on the activity of tyrosinase

圖3　5種黃水對酪氨酸酶的抑制類型分析Fig.3 Inhibition type analyses of five types of yellow water on tyrosinase

2.5黃水對小鼠黑色素瘤細胞B16的細胞學效應

以5種黃水為效應物,蒸餾水為陰性對照,分別研究其對小鼠黑色素瘤細胞B16作用72 h后,細胞增殖率、細胞中的酪氨酸酶活力和黑色素含量的變化,結果如圖4所示.當YW1質量濃度達到100 mg/m L時,酪氨酸酶剩余活力為49.5%;同時,黑色素含量也隨著YW1的增加而減少,抑制率為30.2%.隨著YW2和YW3的質量濃度增加,酪氨酸酶活力和黑色素含量均明顯降低;當YW2質量濃度達到100 mg/m L時,細胞增殖率、酪氨酸酶剩余活力和黑色素含量分別為15.7%,52.7%和44.5%.當YW3質量濃度達到100 mg/mL時,細胞增殖率、酪氨酸酶剩余活力和黑色素含量分別為17.1%,40.9%和46.1%.當YW4質量濃度大于25 mg/mL時,其對酪氨酸酶活力和黑色素含量有一定程度的抑制,但在測定的質量濃度范圍內抑制率不超過30%.當YW5質量濃度僅為1 mg/m L 時,酪氨酸酶活力就已被抑制了12.9%,但隨著YW5質量濃度增大,酪氨酸酶活力在測定的質量濃度范圍內抑制率不超過20.1%;而當YW5質量濃度達到100 mg/m L時,其對黑色素含量影響不大.

表2　5種黃水對酪氨酸酶的抑制效應Tab.2 Inhibitory effects of five types of yellow water on the activity of tyrosinase

3 討 論

上述研究結果表明釀酒的副產物黃水具有很好的抑制酪氨酸酶活力的作用,不同品種高粱產生的黃水對酪氨酸酶的抑制效果不同,這可能是由于其成分存在一定差異所致.由于黃水中含有單寧,我們推測其對酪氨酸酶的抑制作用隨著單寧含量的不同而不同.5種高粱釀酒的副產物黃水按單寧的含量高低依次為YW1>YW3>YW2>YW5>YW4,而對蘑菇酪氨酸酶二酚酶的半抑制濃度由高到低依次為YW3>YW1 >YW2>YW5>YW4,兩者排序基本一致.Chai等從鳳凰木的葉、果實和樹皮中提取單寧,探討其對蘑菇酪氨酸酶的抑制作用,半抑制濃度分別為38,73和54 μg/m L[12];而在我們研究結果中,黃水對酪氨酸酶的半抑制濃度分別為130,178,104,301和230 ng/m L.由此我們推測黃水中對酪氨酸酶起抑制作用的不僅僅是單寧.黃水是由曲霉發酵釀酒時產生的副產物,曲霉發酵時會產生曲酸,Choi等研究發現曲酸的衍生物對酪氨酸酶具有很好的抑制作用[13],所以我們推測黃水對酪氨酸酶的抑制作用是其中單寧與曲酸共同作用的結果,這有待于進一步研究探討.

圖4　5種黃水對小鼠B16細胞增殖率、細胞中的酪氨酸酶活力和黑色素含量的影響Fig.4 The effects of five types of yellow water on cell vability,activity of tyrosinase and content of melanin in mouse B16 cells

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Antityrosinase Properties of Yellow Water Byproduct of Kinmen Kaoliang Making

CHEN Chihmin,CUI Yi,ZHANG Weiyou,HU Yonghua,WANG Qin,CHEN Qingxi*
(Key Laboratory of the Coastal and Wetland Ecosystems,Ministry of Education, School of Life Sciences,Xiamen University,Xiamen 361102,China)

Abstract:The Kinmen Kaoliang was brewed using five species of sorghums,Jinxuan,Liangnuo,Xingxiang,Honggeng and Hongnuo.The byproduct during brewing,the yellow water,was collected,and its inhibitory effect on mushroom tyrosinase was investigated.The results showed that the IC(50)values of five types of yellow water were 130,178,104,301 and 230 ng/m L,respectively, and their inhibition kinetics was reversible,in which the yellow water of Jinxuan,Honggen and Hongnuo displayed a mixed type reversible mechanism,while the one of Liangnuo and Xingxiang displayed an uncompetitive reversible mechanism.Meanwhile,the cell proliferation rate,tyrosinase activity and melanin concentration of mouse B16 melanoma cells were also investigated with five types of yellow water.The data showed that the five types of yellow water had no effect on proliferation of B16 cells.However,the yellow water of Liangnuo and Xingxiang could inhibit the tyrosinase activity of B16 cell at a rate of 52.7%and 40.9%respectively,and could also inhibit the melanin concentration of B16 cells at rates of 44.5%and 46.1%respectively.In all,this study demonstrated that the yellow water not only inhibited the tyrosinase activity,but also inhibited the production of melanin in the B16 cells,implying its potential applications in the cosmetic industry.

Key words:yellow water;component analysis;tyrosinase;B16 cell

*通信作者:chenqx@xmu.edu.cn

基金項目:國家自然科學基金(31271952)

收稿日期:2015-03-14 錄用日期:2015-04-29

doi:10.6043/j.issn.0438-0479.2016.02.009

中圖分類號:Q 356.1

文獻標志碼:A

文章編號:0438-0479(2016)02-0198-05

引文格式:陳志敏,崔沂,張維友,等.金門高粱酒釀造副產物黃水的抗酪氨酸酶性質[J].廈門大學學報(自然科學版),2016,55 (2):198-202.

Citation:CHEN C M,CUI Y,ZHANG W Y,et al.Antityrosinase properties of yellow water byproduct of Kinmen Kaoliang making[J].Journal of Xiamen University(Natural Science),2016,55(2):198-202.(in Chinese)