Ⅰ～Ⅱ期糖尿病腎病大鼠模型擴散張量成像的初步研究

胡小艷，鄔穎華，郭 亮，匡 敏，王 釩

（1.成都中醫藥大學，四川 成都 610075；2.中國醫科大學，遼寧 沈陽 110001；3.成都中醫藥大學附屬醫院放射科，四川 成都 610075）

Ⅰ～Ⅱ期糖尿病腎病大鼠模型擴散張量成像的初步研究

胡小艷1，鄔穎華1，郭 亮2，匡 敏1，王 釩3

（1.成都中醫藥大學，四川 成都 610075；2.中國醫科大學，遼寧 沈陽 110001；3.成都中醫藥大學附屬醫院放射科，四川 成都 610075）

目的：探討Ⅰ～Ⅱ期糖尿病腎病大鼠模型磁共振張量成像（DTI）表現及變化規律。材料與方法：20只SD雄性大鼠，按隨機數字表法將大鼠分為2組，實驗組14只，實際存活9只，共18個腎臟，對照組6只，共12個腎臟；實驗組給予1%鏈脲佐菌素腹腔注射造模，對照組給予同等劑量的檸檬酸緩沖液（pH 4.5）；2周后對兩組大鼠行常規MRI檢查及DTI檢查，在6個非共線方向上施加擴散敏感梯度場，b值取0、600 s/mm2；并留取血尿標本測量尿微量白蛋白、血肌酐；取雙腎行病理檢查；由兩名經驗豐富的放射科醫師盲法觀察及測量雙側腎臟皮質、髓質興趣區的ADC值和FA值。結果：實驗組大鼠血糖明顯升高，兩組血肌酐、尿微量白蛋白均正常；實驗組動物大鼠雙腎病理表現為Ⅰ～Ⅱ期DN損害，對照組大鼠雙腎病理均正常；實驗組大鼠皮、髓質ADC值較對照組增大，差異有統計學意義（P＜0.05）；實驗組皮、髓質FA值比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；實驗組皮、髓質FA值與對照組皮、髓質FA值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論：DTI成像的ADC值和FA值能夠在一定程度上，較血尿生化指標更能反映早期DN的病理改變。

糖尿病腎病；磁共振成像

糖尿病腎病（Diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的微血管并發癥。目前，臨床診斷DN主要依靠血生化檢測及腎穿刺活檢，但前者不能早期發現腎臟功能損害；而后者屬于有創性檢查，很難被患者接受和廣泛應用。近年來，DWI[1-3]、ASL[4-5]等磁共振功能成像技術被逐漸應用于臨床腎臟疾病功能變化的評估。但DWI成像只能反映水分子在單方向上的擴散，不能反映水分子在各向異性的擴散情況。ASL雖然可以通過改變動脈血液的磁化狀態反映組織的灌注情況，但掃描時間很難掌控，不能真實地反映DN微血管灌注情況。而擴散張量成像（DTI）可以在至少6個非共線方向上測量水分子彌散的衰減情況[6]，可以通過ADC值和部分各向異性（FA）值綜合反映水分子在各個方向的擴散，更適合于彌漫性腎臟疾病功能的評價[7]。本研究擬通過對早期DN模型的DTI MRI研究，探討Ⅰ～Ⅱ期DN腎臟功能DTI表現及與其病理的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

清潔級SD雄性大鼠20只，體質量190～280 g。采用隨機數字表法將大鼠隨機分成兩組：實驗組14只，行鏈脲佐菌素（STZ）腹腔注射，誘導糖尿病模型，造模后存活9只，共18個腎臟；對照組6只，給予同等劑量檸檬酸緩沖液腹腔注射，共12個腎臟。

1.2 DN大鼠模型的建立

所有大鼠禁食不禁水12 h，實驗組大鼠按體質量一次性給予1%濃度鏈脲佐菌素溶液，按60 mg/kg的劑量腹腔注射，對照組按相同的濃度、劑量，以相同的方法一次性腹腔注射檸檬酸緩沖液。造模后，兩組大鼠分別單籠喂養，給予相同食水，自由攝食。3 d后，所有大鼠禁食、禁水12 h，取尾靜脈血測量空腹血糖，根據糖尿病診斷標準[8-9]，若實驗組大鼠造模后空腹血糖＞16.7 nmol/L，且出現明顯多飲、多食、多尿、體質量減輕，即“三多一少”癥狀，就確定為糖尿病模型造模成功。于每日晨收集大鼠即時尿液送尿微量白蛋白（mAlb）檢測，連續監測14 d；每日采集尾靜脈血液測量大鼠空腹血糖。2周后，對大鼠行常規MRI及DTI掃描，掃描結束后處死大鼠，取大鼠腹主動脈血液行血清肌酐檢測，取大鼠雙腎，福爾馬林液固定后送病理檢查。DN最后診斷將綜合大鼠臨床、血生化及腎臟病理結果而確定,只有符合Ⅰ～Ⅱ期DN改變的納入研究。

1.3MR成像

采用GE 3.0T磁共振儀，膝關節線圈；對實驗組及對照組大鼠行MRI掃描，10%水合氯醛腹腔注射進行麻醉后取仰臥位，四肢固定。以腎臟為中心，對大鼠行常規T2WI及DTI掃描。掃描序列及參數：T2WI采用FSE-XL序列，軸位，TR 1 918ms，TE 68ms，帶寬31.25 kHz/像素，頻率編碼288，激勵次數4，視野8.0mm×8.0mm，層厚2.0mm，層間距0.2mm，掃描時間111 s；磁共振DTI采用DTI-SE序列，軸位，TR 4000ms，TE 89s，b值取0，600s/mm2，激勵次數4，視野8.0mm×8.0mm，層厚2.0mm，層間距0.2mm，掃描時間260 s。

1.4 圖像處理與數據分析

DTI圖像數據傳送至GE磁共振后處理工作站（AW4.5），由兩名經驗豐富的放射科醫師進行盲法讀片。工作站自動生成相應ADC圖和FA圖，避開變形及有偽影的層面，在靠近腎門水平1～2個層面，皮質和髓質分別放置3個橢圓形ROI，大小約1～3mm2，每個ROI至少5個像素。工作站在ADC圖及FA圖上相應位置自動生成相同的ROI，由兩名醫師盲法測量ADC值及FA值，記錄自動生成的平均值。

1.5 病理檢查

將大鼠腎臟標本用4%多聚甲醛進行固定，并脫水、切片后行HE及PAS染色，在光鏡下觀察切片腎小球及腎小管情況。腎臟病理分級依據Tervaet等[10]2010年提出的新的DN分期標準，Ⅰ期：腎小球基膜增厚，輕度或非特異性光鏡改變；Ⅱa期：輕度系膜增生；Ⅱb期：重度系膜增生；Ⅲ期：結節性硬化；Ⅳ期：球性廢棄＞50%。

1.6 統計分析

采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，實驗中正態計量資料用±s表示，不滿足正態分布資料用“中位數±四分位間距”表示；對所有計量數據進行正態分布檢驗及方差齊性檢驗后，滿足正態分布且方差齊性的資料，行組內及組間兩樣本比較，采用獨立樣本T檢驗，不滿足正態分布的資料比較采用Mann-Whitney Test非參數檢驗方法，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 臨床、生化及病理

實驗組空腹血糖較對照組明顯升高，且具有明顯“三多一少”癥狀（表1）；兩組大鼠血肌酐值、尿微量白蛋白均處于正常范圍，兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）（表2）；對照組所有大鼠雙腎病理均正常，實驗組大鼠雙腎組織的皮髓質清晰；18個腎臟均表現為腎小球基底膜不規則增厚，其中有11個腎臟表現為系膜輕度增生，系膜區增寬，腎小球結構萎縮，部分腎小囊呈空泡樣改變；并見大量腎小管上皮細胞腫脹、脫落，腎小管管腔擴張，管壁變薄。依照最新DN分級標準[10]，實驗組大鼠腎臟病理處于Ⅰ期DN改變腎臟有7個，Ⅱ期有11個（圖1）。

2.2 MRI成像

2.2.1 兩組DTI

表1 造模前后大鼠體質量、血糖及尿量變化情況

表2 造模后2周對照組和實驗組生化結果（±s）

表2 造模后2周對照組和實驗組生化結果（±s）

組別 例數 血糖（mmol/L） 肌酐（μmol/L）尿微量白蛋白（mg/L）對照組 6 5.52±0.62 30.07±6.08 4.57±2.72實驗組 9 30.69±2.07 21.80±7.39 5.08±2.20 P值 0.000 0.091 0.73 t值 28.599 -1.891 -0.359

ADC圖腎臟輪廓清楚，皮髓質分界清楚，皮質呈綠色，髓質呈淺綠色，兩組大鼠ADC圖信號從肉眼上觀察未見明顯差異；FA圖圖像清楚，皮髓質分界清楚，皮質呈深藍色，髓質呈淺藍色，實驗組皮質顏色較對照組變淺，髓質信號差異不明顯（圖2）。

2.2.2 ADC值

實驗組皮、髓質ADC值較對照組皮、髓質ADC值增大，兩組比較有統計學意義（表3）。

2.2.3 FA值

對照組髓質FA值較皮質大，但兩者比較，差異無統計學意義；實驗組髓質FA值較皮質大，兩者比較，差異有統計學意義；實驗組皮、髓質FA值較對照組小，但兩者比較，差異無統計學意義（表4）。

表3 實驗組與對照組皮、髓質ADC值（×10-3mm2/s）

圖1 HE染色。圖1a為對照組，腎小管形態及結果未見明顯變化，腎小球未見萎縮改變；圖1b為實驗組，白色箭頭所示腎小管上皮細胞中度腫脹，上皮細胞空泡化、脫落；黑色箭頭所示腎小球結構萎縮，腎小囊擴大。PAS染色。圖1c為對照組，基底膜形態未見明顯改變；圖1d為實驗組，箭頭示基底膜不規則增厚，基底膜皺曲，系膜細胞輕度增生。Figure 1a,1b.The pathology of HE staining.Figure 1a:The pathology of renal in the control group was normal.Figure 1b:The pathology of experimental group.The white arrow showed that the renal tubular epithelial cells were moderate swelling and the epithelial cell was shedding.The black arrow showed that the structure of glomerular was atrophy and the renal capsule was expansion. Figure 1c,1d. The PAS staining.The basement membrane of renal in the control group was normal(Figure 1c).The arrow showed that the basement membrane was irregular thickening and wrinkling and the mesangial cell was mild hyperplasia in the experimental group(Figure 1d). Figure 2a,2b. The ADC maps of control group and experimental group.The boundary of the cortex and medulla was clear.The color of cortex was green and the medulla was light green.

圖2 圖2a，2b分別為對照組和實驗組大鼠腎臟ADC圖，皮髓質分界清楚，皮質呈綠色，髓質呈淺綠色。圖2c，2d分別為對照組和實驗組FA圖，腎皮質與髓質分界清楚，皮質呈深藍色，髓質呈淺藍色；實驗組皮質顏色變淺。Figure 2c,2d. The FA maps of control group and experimental group.The boundary of the cortex and medulla was clear.The color of cortex was dark blue and the medulla was light blue.The color of the experimental group was lighter than that of the control group.

表4 實驗組與對照組皮、髓質FA值

3 討論

DTI是DWI的發展和深化，不僅能反映組織內水分子的擴散幅度，還能反映各向異性的信息。b值反映DTI的擴散敏感度，低b值主要反映組織的微循環灌注，當b值增加時，組織灌注對ADC值的影響減小，高b值主要反映水分子的彌散情況[11]。DN早期，腎臟病理改變主要是腎小球結構的改變，臨床主要表現為灌注的增加，此時微循環的灌注變化不明顯；而b值越高，所需TE時間越長，圖像信噪比增加，圖像質量受到影響，因此，本研究選擇b值為600 s/mm2，能很好的反映水分子的彌散，對圖像質量影響也較小。

本研究結果顯示，對照組大鼠臨床及生化檢測值均屬正常，實驗組存活大鼠顯示典型糖尿病癥狀，出現多飲、多食、多尿、重量減輕的癥狀，但是，造模后2周所測得的血肌酐及尿微量白蛋白仍處于正常范圍。此時，實驗組大鼠18個腎臟病理檢測結果顯示腎小球及腎小管病理損傷改變，依照病理分期標準[10]， 雙腎均處于Ⅰ～Ⅱ期病理改變。此時，通過MRI DTI成像，ADC圖兩組大鼠雙腎皮髓質信號未見明顯差異，而FA圖顯示實驗組皮質信號較對照組變淺，皮髓質信號差異減小，在DN的Ⅰ～Ⅱ期，FA圖信號已有所改變。Ⅰ～Ⅱ期DN在形態學及臨床生化上無明顯改變，但病理組織學已有改變，功能上DN大鼠處于臨床高濾過期，并伴隨相應的臨床癥狀。

本實驗DTI研究結果顯示，實驗組大鼠腎皮、髓質ADC值較對照組增大。由于實驗組大鼠處于DN的Ⅰ～Ⅱ期，呈高濾過狀態，腎臟病理損害程度小，組織灌注增加，故ADC值增大。與學者Xu等[12]的研究發現一致，Ⅰ期腎病腎臟ADC值與正常腎臟相比，ADC值增大。Hueper等[13-15]在慢性腎臟疾病損傷晚期的研究中發現，晚期腎病患者腎臟ADC值較正常志愿者腎臟ADC值減小。這是由于Ⅲ期以后DN的腎臟微血管損傷嚴重，并出現K-W結節及腎小球硬化等病理損傷，腎組織灌注明顯減小，水分子擴散受到明顯限制，內生肌酐清除率 （Ccr）減小，ADC值減小。

本次研究結果表明對照組腎皮質FA值較髓質小，兩者比較無明顯統計學差異；實驗組皮質FA值較髓質小，兩者間比較有統計學差異。腎皮質由腎小球和腎小管構成，腎臟水分子擴散的各向異性主要由腎小管及其周圍微血管形成的屏障造成，垂直于腎小管方向的水分子擴散受到限制，平行于腎小管方向的水分子擴散更迅速[16]。本研究中實驗組均為DN Ⅰ～Ⅱ期，腎小管上皮細胞腫脹、脫落及腎小管管腔擴張等病理改變使組織間隙縮小，導致水分子擴散的各向異性降低，皮質的FA值則減低，此時皮質與髓質FA值差異較大。在Lu等[7]、Hupper等[12]的研究中，腎小球濾過率減低時，糖尿病組皮髓質FA值較對照組低，而本研究實驗組皮髓質FA值較對照組減小，但兩者皮髓質FA值比較無差異。可能是由于實驗組DN尚處于Ⅰ～Ⅱ期，兩組間皮髓質FA值變化尚不大的緣故。DN早期腎臟病理損傷主要表現為腎皮質的改變，髓質病理改變不明顯，此時皮髓質FA值已經出現差異，說明FA值對DN的早期診斷有一定的參考價值。

綜上所述，DN處于Ⅰ～Ⅱ期時，血肌酐、尿微量白蛋白尚處于正常范圍內，腎臟處于高濾過狀態，皮髓質ADC值增加，DN腎皮質與髓質FA值減小，且皮質與髓質FA值之間有明顯差異。可見，DTI成像技術可通過定量測量ADC值及FA值，反映DN早期腎臟功能的微觀變化。由于本次研究的樣本量偏小，DN的分期單一，DN的DTI研究有待深入，以進一步了解DTI對DN早期診斷及分期診斷的價值，為臨床開展DN DTI早期診斷及療效的評價提供更詳實的實踐及理論依據。

[1]Cakmak P,Yagci AB,Dursun B,et al.Renal diffusion-weighted imaging in diabetic nephropathy:correlation with clinical stages of disease[J].Dir,2014,20(5):374-378.

[2]Li X,Xu X,Zhang Q,et al.Diffusion weighted imaging and blood oxygen level-dependent MR imaging of kidneys in patients with lupus nephritis[J].J Trans Med,2014,12(1):295-301.

[3]Sivrioglu AK,Mehmet A,Kara K,et al.Diffusion-weighted MRI in assessment of renal dysfunction[J].Ind J Radiol Imaging, 2012,22(3):155-159.

[4]Masarapu V,Kim HL.Initial experience with arterial spin-labeling MR imaging to assess histology of renal masses[J].Quant Imaging Med Surg,2013,3(3):130-131.

[5]Zhang JL,Morrell G,Rusinek H,et al.New magnetic resonance imaging methods in nephrology[J].Kid Int,2014,85(4):768-778.

[6]Chuck NC,Steidle G,Blume I,et al.Diffusion tensor imaging of the kidneys:influence of b-value and number of encoding directions on image quality and diffusion tensor parameters[J].J Clin Imaging Sci,2013,3(4):53.

[7]Lu L,Sedor JR,Gulani V,et al.Use of diffusion tensor MRI to identify early changes in diabetic nephropathy[J].Am J Nephrol, 2011,34(5):476-482.

[8]李曉玲，朱旅云，宋光耀，等.臍帶間充質干細胞移植對1型糖尿病大鼠模型血糖及腎臟不能改變的影像研究 [J].解放軍醫藥雜志，2013，25（7）：31-34.

[9]田佳星，趙靜波，李敏，等.糖胃安方對鏈脲佐菌素誘導的1型糖尿病大鼠小腸生物力學重構的影響[J].中國糖尿病雜志，2015，23（7）：637-643.

[10]Tervaert TW,Mooyaart AL,Amann K,et al.Pathologic classification of diabetic nephropathy[J].JASN,2010,21(4):556-563.

[11]Morani AC,Elsayes KM,Liu PS,et al.Abdominal applications of diffusion-weighted magnetic resonance imaging:where do we stand?[J].WJR,2013,5(3):68-80.

[12]Xu X,Fang W,Ling H,et al.Diffusion-weighted MR imaging of kidneys in patients with chronic kidney disease:initial study [J].Eur Radiol,2010,20(4):978-983.

[13]Hueper K, Hartung D, Gutberlet M, et al. Magnetic resonance diffusion tensor imaging for evaluation of histopathological changes in a rat model of diabetic nephropathy[J]. Invest Radiol,2012, 47(7): 430-437.

[14]Xu Y, Wang X, Jiang X. Relationship between the renal apparent diffusion co -efficient and glomerular filtration rate: preliminary experience [J]. J Magn Reson Imaging, 2007, 26(3):678-681.

[15]Ries M,Basseau F,Tyndal B,et al.Renal diffusion and BOLD MRI in experimental diabetic nephropathy.Blood oxygen leveldependent[J].J Magn Reson Imaging,2003,17(1):104-113.

[16]葉靖,吳晶濤，張萍.磁共振擴散張量成像對新西蘭白兔糖尿病腎病診斷價值的初步研究[J].中國現代醫學雜志，2012，22（16）：37-39.

A preliminary study in stageⅠ andⅡ of diabetic nephropathy rats using diffusion tensor imaging MRI at 3.0T

HU Xiao-yan1,WU Ying-hua1,GUO Liang2,KUANG Min1,WANG Fan3
(1.Chengdu University of TCM,Chengdu 610075,China;2.China Medical University,Shenyang 110001,China; 3.Department of Radiology,the Affiliated Hospital of Chengdu University of TCM,Chengdu 610075,China)

Objective:To prospectively assess the manifestation of stageⅠ andⅡ diabetic nephropathy rats using diffusion tensor imaging(DTI)MRI at 3.0T.Materials andMethods:Twenty male SD rats were randomly divided into 2 groups according to the random number table.Fourteen rats were in the experimental group,the final survival of 9 rats with 18 kidneys,and 6 rats were in the control group with 12 kidneys.The experimental group was treated with 1%streptozotocin,and the control group was given the same dose of citrate buffer solution.Two weeks later,both of the two groups of rats underwent conventional MRI and DTI examination with b value of 0 and 600 s/mm2(diffusion directions=6),and the serum creatinine and microalbuminuria were measured and the pathological change of all kidneys were examined.Mean apparent diffusion coefficient(ADC)and fractional anisotropy(FA)were determined for the cortex and the medulla by two experienced radiologists blinded.Results:The blood glucose of experimental group was significantly increased,and the serum creatinine and microalbuminuria in both of the two groups of rats were normal.The pathological changes of the kidneys in the experimental group were stageⅠ andⅡ diabetic nephropathy expression,and the control group was normal.The ADC values of cortex and medulla were increased in the experimental group compared with the control group and the difference was statistically significant(P＜0.05).In the experimental group,the difference of FA values were statistically significant between cortex and medulla (P＜0.05).While there were no significant differences in the FA values of the cortex and medulla between two groups(P＞0.05).Conclusion:The ADC value and FA value of DTI imaging maybe be more able to reflect the pathological changes than the biochemical indicator in the early stage of diabetic nephropathy.

Diabetic nephropathies;Magnetic resonance imaging

R587.2；R445.2

A

1008－1062（2016）11－0795－04

2016－04－05；

2016－05－19

胡小艷（1990-），女，四川綿陽人，在讀碩士研究生。E-mail：615313178@qq.com

鄔穎華，成都中醫藥大學，610075。E-mail：wuyinghua_1111@163.com

四川省教育廳自然科學重點項目（編號：132A0285）。