新疆革蜱源性綿羊無漿體病原DNA檢測

張玉婷， 孟 元，郭慶勇,王振寶，吳 敏，張 楊，巴音查汗

(1.新疆農業大學動醫學院，烏魯木齊 830052；2.浙江大學生科院，杭州 310058)

新疆革蜱源性綿羊無漿體病原DNA檢測

張玉婷1， 孟 元2，郭慶勇1,王振寶1，吳 敏2，張 楊1，巴音查汗1

(1.新疆農業大學動醫學院，烏魯木齊 830052；2.浙江大學生科院，杭州 310058)

【目的】探究新疆部分地區羊體表寄生的優勢革蜱攜帶病原狀況。【方法】采用形態學(借助顯微鏡)和分子生物學(革蜱種屬特異性ITS-2F、ITS-2R引物進行擴增)方法，對采集于阿勒泰、巴音郭楞州等地州羊體表寄生的蜱蟲(N=267)進行種屬鑒定，對其攜帶的綿羊無漿體病原(MSP4基因為靶標) DNA 進行PCR檢測。【結果】當地羊體表寄生的優勢種革蜱為草原革蜱(D.nuttalli)、森林革蜱(D.slivarum)和邊緣革蜱(D.marginatus)，均能攜帶病原MSP4基因，且這三種革蜱種特異基因擴增產物序列(820 bp)與已登錄記載的同種革蜱的核苷酸同源性為99%。被革蜱叮咬的126份羊全血樣品中 34份為綿羊無漿體陽性，均能擴增出850 bp目的基因條帶。【結論】新疆阿勒泰地區、巴音郭楞州等地州羊群感染了綿羊無漿體病，其陽性率為27%(34/126)。為進一步研究新疆革蜱的公害州及羊無漿體病的綜合防治提供科學依據。

革蜱；鑒定；綿羊無漿體；病原DNA；檢測

0 引言

【研究意義】蜱隸屬于節肢動物門，蛛形綱，蜱螨目，蜱亞目，是一類以吸取宿主血液為生的體表寄生蟲[1,2]。我國已記載的蜱種110種，分為硬蜱和軟蜱兩大類[3]。【前人研究進展】硬蜱直接叮咬或攜帶病原體對宿主造成傷害，直接危害表現為被叮咬動物騷動不安和傷口感染而致生產性能下降，大量寄生時，分泌的毒素引起動物麻痹, 造成蜱癱[4-5]；更重要的是它是許多病原體的傳播媒介和保蟲宿主[6]。其中以革蜱作為傳播媒介的疾病主要有：森林腦炎(Forest-spring Encephalitis)、萊姆病(lyme disease)、土拉菌病( Tularaemia)、北亞蜱媒斑點熱(Rickettsiosis sibirica)、Q熱(Q fever)及人畜共患無漿體病等，給人類健康和畜禽業造成嚴重危害[2]，已成為全球醫學界和獸醫學界倍加關注的公共衛生問題[7-8]。【本研究切入點】新疆幅員遼闊，羊養殖業發達，如阿勒泰和巴音郭楞州等地州的大部分羊群均自然放牧為主，容易被硬蜱侵襲導致蜱媒疾病。【擬解決的關鍵問題】研究從自然放牧羊群中隨機采樣，了解當地羊身上吸血蜱的優勢種媒介蜱的同時，檢測其攜帶病原狀況，即革蜱源性綿羊無漿體病原的感染情況等，為新疆綿羊無漿體病及其媒介蜱的有效防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗動物、蜱、全血

阿勒泰和巴音郭楞州自然放牧羊群隨機采樣，其中采集于羊體表吸血的蜱蟲為267只，羊全血為126份。

蜱：采集于新疆阿勒泰地區綿羊無漿體流行區的羊體上未吸血活蜱、半飽血活蜱和飽血活蜱約1 654只(雌雄均有)，從中隨機抽取119只雄蜱，148只雌蜱作為檢測樣品(除去飽血和半飽血蜱蟲)，且保證從各地區最少抽到雌蜱和雄蜱各25只。全血：采集被革蜱叮咬的126份羊全血樣品，保存于-20°C,備用。

1.1.2 試劑及儀器

10% 的NaOH、乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%)、1:1的無水乙醇丙二醇、100%丙二醇、中性樹膠、甲醇、蒸餾水；瓊脂糖、溴化乙錠；PCR permix；DNA Mark(康為)；基因組提取試劑盒(賽百盛)，質粒提取試劑盒(OMEGA)，膠回收試劑盒(OMEGA)。

顯微鏡(Motic BA400)，組織解剖鏡(Motic SMZ-168)，培養箱，溫度和濕度表，氧化鋅膠袋，挑蟲針，玻璃管，HWS12型電熱恒溫水浴鍋；移液器，PCR儀(美國Bio-Rad公司)，Gel Doc2 000紫外凝膠成像系統，DYCP-31DN型水平電泳槽，掃描電鏡(日立序520型)。

1.2 方 法

1.2.1 形態學鑒定

2.4.3 浸出物檢測 采用熱浸法測定，直接粉碎得到的枸杞子粉末與經上述3種預處理方法得到的枸杞子粉末，其浸出物量分別為75.4%、75.6%、72.6%、72.5%，均未少于55.0%。

1.2.1.1 蜱的玻片標本制作與觀察對蜱蟲樣品進行清洗處理，從外觀特征上初步分類，鏡下對其做進一步鑒定。蜱在制片之前，需先用10%的NaOH或KOH水溶液煮沸數分鐘，直至蟲體內部的肌肉和內臟被溶解排出，蟲體軟化透明為止。然后經清洗-脫水(依次經過30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇)-透明(乙醇和1:1的無水乙醇丁香油、純丁香油各0.5～1 h)-封片(用光學樹脂膠或加拿大樹膠封片)后鏡檢。

1.2.1.2 光學顯微鏡觀察革蜱，形態學鑒定要點借助體視鏡觀察革蜱的盾板、假頭、假頭基形狀、口下板、生殖孔、肛溝、氣門板及足基節等形態特征，根據新疆蜱類志分類檢索表進行形態學分類鑒定[9]。

1.2.2 革蜱分子生物學鑒定

1.2.2.1 引物的設計與合成根據實驗室已建立的革蜱類鑒定的PCR檢測方法進行檢測，目的片段大小為820 bp。上游引物：ITS-2F:5'-TCGTCTGTCTGAGGGTCGGA-3'，下游引物:ITS-2R:5'-TCGTCTGTCTGAGGGTCGGA-3'，主要擴增革蜱種屬特異性核酸。

參考de la Fuente等[10]合成檢測山羊無漿體MSP4基因的引物，預計擴增片段長度為850 bp，上游引物SF：5'-CCGGATCCTTAGCTGAACAGGAATCTTGC-3'；下游引物：5'-GGGAGCTCCTATGAATTACAGAGAATTGTTTAC-3'。所有引物均由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。

1.2.2.2 革蜱DNA及羊全血DNA的提取將單個蜱蟲樣品置于大平皿中用蒸餾水刷洗干凈后，在研缽中研磨充分后，加入200 μL PBS(1×)緩沖液，20 μL Proteinase K消化液，混勻，與56℃恒溫水浴鍋消化30 min后，用DNA提取試劑盒進行革蜱基因組DNA的提取；取綿羊血液300 μL用DNA提取試劑盒提取，DNA分裝后-20℃保存備用。

1.2.2.3 革蜱DNA的PCR鑒定革蜱源性DNA擴增PCR反應體系(20 μL)：2×TaqMaster Mix 10 μL，ITS-2F(10 μM)2 μL，ITS-2R(10 μM)2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 4 μL。PCR反應程序：94℃預變性4 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,35個循環；72℃延伸7 min，4℃保存。

1.2.3 革蜱源性無漿體MSP4的PCR檢測羊無漿體反應體系(20 μL)：2×TaqMaster Mix 10 μL，SF(10 μM)2μL，SR(10 μM)2 μL，模板DNA 2 μL(1.2.2.2中的綿羊全血DNA)，ddH2O 4 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環；72℃延伸7 min，4℃保存。

2 結果與分析

2.1 革蜱形態學鑒定

借助顯微鏡下形態，如盾板琺瑯斑、氣門板、假頭基、足基節、緣朵、眼等形態結合革蜱相關檢索表進行革蜱種屬鑒定。研究表明，此次采集點羊體表寄生的優勢種革蜱為草原革蜱(D.nuttalli)、森林革蜱(D.slivarum)和邊緣革蜱(D.marginatus)。

2.1.1 草原革蜱(Dermacentornuttalli)

盾板亞圓形，寬闊，其上琺瑯彩明顯。足轉節Ⅰ背距短，末端圓鈍。足基節Ⅳ外距不超過該節后側緣。氣門板背突較直而短，不達盾板邊緣，其背緣無幾丁質增厚部。成蜱主要寄生在羊、牛、馬等大型家畜體表，有時也侵襲人。可傳播巴貝斯蟲和無漿體等。

2.1.2 森林革蜱(Dermacentorsilvarum)

盾板琺瑯彩明顯，足轉節I背距末端尖細。足基節Ⅳ外距明顯，末端超出該節后緣，氣門板逗點形，背突末端伸達盾板邊緣，背緣無幾丁質增厚部。成蟲寄生在各種家畜和大型野生動物體表，也侵襲人,可傳播巴貝斯蟲和無漿體等。

2.1.3 邊緣革蜱(Dermacentormarginatus)

盾板琺瑯彩較淡，足較粗壯。基節I外距明顯短于內距。基節II、III外距短小，呈齒狀, 氣門板大，長逗點形，背突微彎，伸至盾板邊緣，末端寬窄有變異。成蟲寄生在羊、牛、馬等大型家畜體表，可傳播巴貝斯蟲和無漿體等。

2.2 革蜱分子生物學鑒定

2.2.1 革蜱ITS-2序列PCR擴增

以所提取的蜱蟲基因組DNA為模板，經ITS-2F、ITS-2R引物進行PCR擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，擴增出大小為820 bp的電泳條帶，與目的片段相符。圖 1

M：DNA分子質量標準；1～18：部分樣品的PCR產物；19：陰性對照

2.2.2 革蜱源性羊無漿體病原DNA檢測結果

以所提取的革蜱及羊血液基因組DNA為模板，經SF、SR引物進行PCR擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，擴增出大小為850 bp的電泳條帶，與目的片段相符。圖 2

M:DNA分子質量標準,1～10:1～10號樣品的PCR產物

2.2.3 革蜱及其攜帶羊無漿體病原基因克隆測序

2.2.3.1 革蜱種屬特異性基因克隆的測序

選取圖1前10個樣品中，PCR產物強陽性的條帶，擴大PCR反應體系至50 μL，做膠回收，將膠回收產物連接至T載體，經轉化培養，將提取的質粒進行PCR鑒定，得到預期大小的片段。測序結果表明，采集蜱蟲的ITS序列與NCBI中登錄的慶陽株(JQ737109.1)和平涼株(JQ737108.1)同源性均為99%，判定出該蜱蟲為邊緣革蜱、草原革蜱及森林革蜱。

2.2.3.2 羊無漿體病原基因克隆的測序

同源性比對發現，所獲得的綿羊無漿體MSP4序列與綿羊無漿體甘肅株(HQ456347)同源性最高，達到100%，與其他綿羊無漿體同源性為99%，與邊緣無漿體的同源性為94%。由此可知，新疆阿勒泰地區部分羊感染的是綿羊無漿體，其感染率。表1

表1 所采集革蜱攜帶無漿體情況

Table.1 Faunal distribution of mediaDermacentorin Xinjiang

革蜱種革蜱數量革蜱對應的綿羊全血份數綿羊無漿體MSP4陽性數量綿羊無漿體MSP4陽性率(%)草原革蜱100421433 3森林革蜱10042819 0邊緣革蜱67421228 6總計2671263427 0

3 討 論

試驗將形態學與分子生物學結合鑒定羊體表吸血的革蜱類，發現羊體表寄生的革蜱優勢種為草原革蜱、森林革蜱、邊緣革蜱。依據三種新疆革蜱類優勢分布種的生物學特征[10-12]及其攜帶病原狀況，可建議在革蜱活動季節新疆阿勒泰、巴州等地放牧區域羊群加強對革蜱侵襲羊群吸血而導致無漿體病。與孫明等[13]報道的甘肅景泰縣的羊無漿體的感染(30.6%)相比，新疆阿勒泰、巴州的部分羊感染有綿羊無漿體感染率(27%)相近，這說明新疆阿勒泰、巴州地區的部分羊感染了綿羊無漿體，需要加強對革蜱的生物防控。另外，被媒介革蜱叮咬的羊群全血內存在綿羊無漿體，該情況與殷宏等[14]報道的一致。

4 結 論

研究為羊體表吸血革蜱種及其攜帶病原等的檢查提供了一種簡便、準確的分子生物學方法，同時為蜱媒疾病控制及蜱媒種群分析等研究工作提供了基礎。

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Fund project:Supported by Supporting Xinjiang by Science and Technology Program (2013911061)

The DNA Detection of Dermacentor-borneAnaplasmaovisin Xinjiang

ZHANG Yu-ting1, MENG Yuan2, GUO Qing-yong1, WANG Zhen-bao1,WU Min2, ZHANG Yang1, Bayinchahan1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China; 2.CollegeofLifeSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058)

【Objective】 To explore the situation of pathogen of Dermacentor on the surface of sheep from parts of Xinjiang. 【Method】 The dermacentor species of grazing flocks surface parasitic ticks acquisited from Altay, Korla and other places in Xinjiang were identified by using morphology (through microscopy) and molecular biology method (amplification of Dermacentor species-specific ITS -2F, ITS-2R primers). In addition, pathogen ofAnaplasmaovis(MSP4 gene as targets) was detected by PCR. 【Result】 The results showed that the advantages ofDermacentorfrom local sheep wereD.nuttalli,D.slivarumandD.marginatusand they all carriedAnaplasmaovis. The amplification product of specific gene primers from these Dermacentor was about 820 bp. Homology analysis indicated that the nucleotide of tested samples had 99% homology with that of the same species ofDermacentornucleotidelogged GenBank. Its nucleotide homology with that from GenBank was up to 99%. There are 34 positive samples which were amplificated by target gene primers (about 850 bp) in 126 whole blood samples, which suggested that sheep from Altay and Korla were infected with Amplasam ovis and the rate of infection was 27%.【Conclusion】 The test has provided scientific basis for further study of the disadvantages ofDermacentorin Xinjiang and for the prevention and control ofAmplasamovis.

Dermacentor; identification;Amplasamovis; DNA of pathogen; detection

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.01.025

2015-05-06

自治區科技支疆項目(2013911061)

張玉婷(1989-)，女，云南大理人，碩士研究生，研究方向為寄生蟲分子免疫學，(E-mail)529652225@qq.com

巴音查汗(1964-)，女，新疆人，教授，博士生導師，研究方向為預防獸醫學，(E-mail)bynch@hotmail.com

S852.74+6

A

1001-4330(2016)01-0185-05