三種膳食纖維對Caco-2細胞膽固醇轉運的影響

章海風　姜明霞　程　音　葉變良　翟成凱

(東南大學公共衛生學院，江蘇　南京　210096)

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三種膳食纖維對Caco-2細胞膽固醇轉運的影響

章海風1姜明霞程音1葉變良1翟成凱

(東南大學公共衛生學院，江蘇南京210096)

〔摘要〕目的探討分別來源于單一小麥、玉米和多種谷物與豆組合的膳食纖維對Caco-2細胞膽固醇轉運的影響。方法對人結腸腺癌細胞系Caco-2細胞株進行體外培養，形成單層模型后，培養液中加入膽固醇膠囊和不同濃度的膳食纖維；MTT比色法檢測細胞的生長情況，高效液相色譜法測定細胞液中的膽固醇含量。結果在100 μg/ml的膳食纖維干預濃度下，3種膳食纖維均顯著減少了高膽固醇狀態下Caco-2細胞單層模型的膽固醇轉運(P<0.05)；至實驗結束時，多種谷物與豆組合膳食纖維對膽固醇轉運的抑制作用要好于單一小麥膳食纖維和玉米膳食纖維(P<0.05)。結論三種膳食纖維，尤其是多種谷物與豆組合膳食纖維對Caco-2細胞單層模型的膽固醇轉運有一定的抑制作用。

〔關鍵詞〕膳食纖維；Caco-2細胞；膽固醇

Caco-2細胞是來源于人類結腸和直腸的癌細胞〔1〕,是觀察腸道對物質吸收、轉運和代謝功能的經典體外模型之一〔2~5〕。作為動物實驗的良好替代方法〔6〕,可用于檢測受試物對腸道膽固醇吸收轉運影響的研究〔7~9〕。已有的文獻也表明〔10,11〕，膳食纖維(DF)可影響人體小腸對膽固醇的吸收，調節人體的脂代謝,但不同食物來源的膳食纖維具有不同的功能作用。本文旨在探討來自小麥、玉米和多種谷物與豆組合的不同來源膳食纖維對Caco-2細胞單層模型膽固醇轉運的影響。

1材料與方法

1.1細胞與材料Caco-2細胞株由江蘇省中醫藥研究院提供(美國休斯頓大學胡明教授饋贈)；膳食纖維由本實驗室采用酶-化學法分別提取；DMEM高糖培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自美國Equitech-Bio公司；膽固醇、大豆卵磷脂、牛磺膽酸鈉、膽固醇試劑盒購自美國Sigma公司；依折麥布片劑(Ezetimibe)是批準用于臨床的選擇性膽固醇吸收抑制劑，購自新加坡Schering-Plough公司。

1.2Caco-2細胞的培養將復蘇后的Caco-2細胞以2×105/ml密度接種于25 cm2的細胞培養瓶中，加入5 ml含10%FBS、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、0.1 U/L青霉素-鏈霉素雙抗的不完全DMEM培養基，于37℃、5%CO2培養箱中靜置培養。定時更換細胞培養液，待細胞生長至80%~90%時用胰酶消化、傳代，選取對數生長期的細胞用于轉運實驗研究。

1.3Caco-2細胞電阻值的測定先將Millicell-ERS型細胞電阻儀的電極在70%乙醇中浸泡15 min，空氣中干燥15 min，然后放入與培養液相似的無菌電解質中浸泡15 min。Caco-2單細胞層用HBSS沖洗細胞3次，將電極分別放置于TransWellTM培養板中A側小室與B側小室測定電阻值，并計算跨膜電阻〔12〕。直徑為2.4 cm的6孔板，電阻值的計算公式為：TEER=1.2×1.2×3.14×(Ω1-Ω2)(Ω1為干預前測量電阻，Ω2為空白電阻)。

1.4實驗分組陰性對照組(CL)：正常培養，不加干預物；膽固醇模型組(CH)：膽固醇膠囊培養基；陽性對照組(E)：膽固醇膠囊+10 μmol/L依折麥布；小麥DF(W)：膽固醇膠囊+小麥DF；玉米DF(C)：膽固醇膠囊+玉米DF；多種谷物與豆組合DF(CSC)：膽固醇膠囊+多種谷物與豆組合DF。

1.5膽固醇膠囊溶液的配制膽固醇膠囊作為膽固醇培養液中的膽固醇源，采用溶劑誘導法進行配制，具體參照文獻〔13〕。實驗前配制，稱取卵磷脂(0.6 mmol/L)溶于甲醇溶液，超聲后N2干燥；再加入牛磺膽酸鈉(2 mmol/L)和膽固醇(1 mmol/L)，加入乙醇超聲溶解，N2干燥；最后溶解在pH 7.4的HBSS溶液中,0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，儲存備用。

1.63種膳食纖維影響Caco-2細胞存活率的MTT試驗分別將膳食纖維按照不同濃度(50、100、200、400 μg/ml)置于pH7.4培養基中，超聲溶解并通過0.45 μm的濾過膜，37℃保存備用。

將Caco-2細胞以每孔2 000個的濃度接種到96孔板，每孔體積200 μl，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養24 h，然后加入不同濃度的膳食纖維培養基孵育24 h。對照組為Caco-2細胞在完全培養基中孵育24 h，用HBSS溶液洗滌3次后，棄去上清液，加入20 μl MTT溶液，無血清培養基180 μl，37℃繼續孵育4 h后終止培養，小心棄去上清液，然后加入200 μl DMSO，輕輕吹打混勻，轉移200 μl至新的96孔板中，將培養板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，使結晶物充分溶解，在酶聯免疫熒光儀波長490 nm處測OD值，記錄結果。

取5孔OD值得均數，按下公式算出細胞存活率(IC)：細胞存活率(IC)= 〔實驗孔OD均值/對照孔OD均值〕×100%。

98%的細胞存活所對應的膳食纖維濃度(IC98)作為干預的敏感劑量，轉運實驗選擇應低于此劑量。

1.73種膳食纖維抑制Caco-2細胞膽固醇轉運的試驗方法將小麥DF、玉米DF和多種谷物與豆組合DF分別配制成一定的濃度，溶解在HBSS膽固醇膠囊溶液中，其中陽性對照組為10 μmol/L依折麥布溶液，超聲溶解并通過0.45 μm的濾過膜，37℃保存備用。

選取符合轉運條件且細胞生長形態完好的TransWellTM膜，移至到有1.5 ml HBSS的新的6孔板，往A側輕柔加入0.5 ml HBSS，于37℃輕柔振動15 min后，HBSS清洗3遍，并檢測每孔細胞TEER值3次，取平均值。移出上下兩小室的HBSS緩沖液，盡量吸干凈殘余的液體，然后添加0.4 ml含有膳食纖維的供液于A側支持膜上，添加1.2 ml HBSS溶液于B側，分別在不同時間(0 min、30 min、60 min、90 min及120 min)吸取0.4 ml接收液，同時補加0.4 ml空白接收液。利用高效液相色譜法測定膽固醇的含量，最后一次取樣后計算質量平衡。

1.8膽固醇含量的檢測本文采用高效液相色譜(HPLC)法〔14,15〕測定Caco-2細胞滲透液中的膽固醇的含量。色譜條件：色譜柱Poroshell 120 EC-C18(2.7 μm,2.1 mm×50 mm)。流動相：甲醇(100%)。流速為0.3 ml/min，檢測波長為205 nm，柱溫為38℃，進樣量為10 μl。

在已選定的高效液相色譜條件下，將配好的標準溶液系列進行測試，以膽固醇濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。分別配制不同濃度的膽固醇標準溶液，濃度分別為2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/ml,通過HPLC測定其峰面積，根據膽固醇濃度與峰面積的關系，回歸直線方程為Y=128.4+904.4X，相關系數r=0.999。

1.9數據處理與統計分析采用SPSS15.0軟件進行one-way ANOVA檢驗、SNK檢驗。

2結果

2.1Caco-2細胞單層模型的電阻值本次細胞生長狀態良好，轉運前細胞TEER值平均保持在482~595 Ω/cm2左右(CL：534.3±27.0，CH：508.7±51.5，E：507.9±30.5，W：571.2±77.7，C：580.3±50.6，CSC：517.7±42.6)，每孔之間也未見統計學差異(P>0.05)，說明Caco-2細胞在TransWellTM板中培養21 d后已經形成了完整的單層細胞模型，可以用于物質的轉運實驗〔16〕。

2.23種膳食纖維對Caco-2細胞存活率的影響Caco-2細胞對3種膳食纖維的敏感劑量各不一樣。由表1可見，小麥DF和多種谷物與豆組合DF，隨著濃度由50 μg/ml增加到400 μg/ml，其細胞的存活率(IC)均呈增加趨勢；玉米膳食纖維濃度在100 μg/ml時，其細胞的存活率(IC)最高，表明谷物膳食纖維在一定濃度范圍內對Caco-2細胞的存活具有一定的促進作用。本次試驗選擇膳食纖維干預的轉運濃度為100 μg/ml。

2.33種膳食纖維對Caco-2細胞膽固醇轉運的影響從圖1可以看出，在100 μg/ml的DF干預濃度下，隨著時間延長，每種細胞液中的膽固醇濃度均呈上升趨勢。膽固醇模型組上升趨勢最明顯，30~120 min時，膽固醇模型組細胞液中的膽固醇濃度顯著高于其余各組(P<0.05)。陽性對照組抑制膽固醇轉運的影響最為明顯，在30 min時，依折麥布完全抑制了膽固醇的轉運，30 min后才開始檢測出轉運的膽固醇，至實驗結束，陽性對照組的膽固醇轉運濃度緩慢上升，膽固醇濃度顯著低于膽固醇模型組和膳食纖維干預組。與膽固醇模型組相比，膳食纖維組膽固醇濃度顯著降低(P<0.05)。比較3種谷物DF，30 min時多種谷物與豆組合DF組和小麥DF組，抑制膽固醇轉運的作用好于玉米DF組，而多種谷物與豆組合DF和小麥DF對Caco-2細胞膽固醇轉運具有相似的抑制性。至120 min實驗結束時，3種膳食纖維之間未見明顯差異(P>0.05)。在試驗過程中，陰性對照組細胞液中始終未檢測出膽固醇，在圖1中不再顯示。

表1　不同濃度膳食纖維對Caco-2細胞存活率的影響(%)

圖1　3種膳食纖維對Caco-2細胞膽固醇轉運的影響

3討論

Caco-2細胞是來源于人類結腸和直腸癌的細胞，結構和功能類似于分化的小腸上皮細胞，具有微絨毛等結構，并含有與小腸刷狀緣上皮相關的酶系，成為一個比較理想的體外小腸吸收模型，常常被用來檢測一些口服藥物和外源性物質的吸收效果。經過21 d左右的培養，形成單層模型，在腸腔側分化出絨毛面AP側(腸腔側)和基底面BL側(腸內壁側)。AP側含有典型的小腸微絨毛水解酶和各種營養物質的轉運載體，可發揮主動轉運物質的作用，如糖類、氨基酸、膽酸及維生素B內源性因子的主動轉運載體在Caco-2細胞都有表達；存在于小腸細胞刷狀緣的酶，如氨肽酶、堿性磷酸酶、蔗糖酶等也同樣存在于細胞中。研究物質從小腸的漿膜層到黏膜側和從黏膜側到黏膜層吸收特性，可以清晰地表達藥物的轉運與排泄方式〔17〕。利用細胞電阻儀測定跨上皮細胞的電阻，是一個常用的、有效的方法，可反映出經過21 d培養后的Caco-2單層細胞緊密性和完整性，決定培養后的Caco-2細胞能否進行進一步的轉運實驗。本實驗在細胞培養過程中，發現Caco-2細胞生長7 d后達到融合，10 d后細胞開始均勻致密，在光學顯微鏡下可清晰看見呈多角形扁平狀的單個細胞體，多細胞間緊密連接，細胞生長狀態良好，與文獻報道相一致〔18〕。Caco-2細胞在TransWellTM板中培養21 d后已經形成了完整的單層細胞模型，可以用于本文膽固醇的轉運實驗。

目前，已有較多關于利用Caco-2細胞單層模型來觀察藥物或外源性物質對人體小腸膽固醇吸收和轉運影響的實驗研究。馮丹等〔19〕實驗結果顯示，25～100 μmol/L姜黃素可有效降低Caco-2細胞NPC1L1的基因和蛋白表達，顯著抑制細胞膽固醇的吸收。趙戰芝等〔20〕利用Caco-2細胞模型來研究大蒜素對腸道膽固醇外排及膽固醇轉運基因ABCG5/ABCG8表達的影響，結果表明，與對照組比較，膽固醇微膠粒可增加Caco-2細胞內脂滴和膽固醇含量，而大蒜素可減少膽固醇微膠粒處理后Caco-2細胞內脂滴和膽固醇含量，增加細胞內膽固醇排出率，并可顯著上調Caco-2細胞ABCG5和ABCG8的蛋白水平。因此，在借鑒文獻研究的基礎上，筆者通過建立Caco-2細胞模型，研究小麥、玉米和多種谷物與豆組合3種膳食纖維對膽固醇吸收轉運的影響。同時，考慮到膳食纖維是一種難溶性的物質，而且理論上也無法透過細胞膜進入細胞，因此，本實驗主要研究了膳食纖維對膽固醇從AP側到BL側轉運的影響。本章實驗結果也顯示，膽固醇模型組Caco-2細胞中，膽固醇的轉運量顯著增加，而3種膳食纖維和陽性對照物可明顯抑制高膽固醇狀態下Caco-2細胞中膽固醇的轉運。依折麥布是一種用于臨床的選擇性膽固醇吸收抑制劑，可作用于小腸細胞的刷狀緣，以甾醇載體(NPC1L1)為分子靶點〔21〕，選擇性地抑制腸道對食物中TC以及膽汁中TC的吸收，從而使膽固醇由腸道向肝臟運輸相應減少〔22〕。膳食纖維對Caco-2細胞單層模型膽固醇轉運的抑制作用，可能是調節了Caco-2細胞單層模型中NPC1L1的表達，從而抑制了膽固醇的轉運；其次，已有的研究表明，膳食纖維具有一定的持水性、膨脹性、黏稠性和吸附性等理化特性，因此，吸水溶脹的膽固醇，增加了細胞液的黏稠性，阻礙了膽固醇的轉運。膳食纖維對膽固醇的物理性吸附，也降低了膽固醇的濃度，從而降低了膽固醇的轉運。

本實驗結果還表明，至實驗結束時，3種膳食纖維對膽固醇轉運表現出了不同的抑制效果。多種谷物與豆組合膳食纖維對Caco-2細胞中膽固醇轉運的抑制作用好于小麥DF和玉米DF組，但三者之間未見明顯的統計學差異，還需要作進一步的深入研究。不同食物來源的膳食纖維對人體健康的保健作用有所不同，這與其自身結構、理化特性和來源具有一定的關聯。根據本課題組之前的研究表明，多種谷物與豆組合DF比單一的小麥DF和玉米DF ,具有更強的持水性、膨脹性和膽固醇吸附能力等，這可能是多種谷物與豆組合DF對膽固醇的抑制作用好于單一小麥DF和玉米DF的原因之一。

綜上，膳食纖維對Caco-2細胞膽固醇的轉運吸收有一定的抑制作用。其作用機制可能是物理性地阻礙了膽固醇物質的轉運，也可能是通過抑制膽固醇轉運蛋白NPC1L1表達，降低腸細胞對膽固醇的吸收轉運。膳食纖維對Caco-2細胞膽固醇轉運的影響可能是多渠道的，其具體機制有待進一步研究。

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〔2015-11-20修回〕

(編輯曲莉)

Effects of three kinds of dietary fiber on cholesterol transport in Caco-2 cells

ZHANG Hai-Feng, JIANG Ming-Xia, CHENG Yin,etal.

School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210096,Jiangsu, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the dietary fiber (DF) from wheat (W), corn (C), and cereal-soybean combination(CSC) on cholesterol transport in Caco-2 cells.MethodsThe human colon adenocarcinoma cell line Caco-2 was cultured in vitro. After the monolayer model was formed, cholesterol micelles and different concentrations of dietary fiber were added into the culture medium. The growth of cells was detected by MTT colorimetry. The cholesterol content in the cell was determined by HPLC.ResultsIn the intervene of 100 mg/ml DF concentration, three kinds of DF were significantly reduced cholesterol transport in Caco-2 cell monolayer model under the high cholesterol concentration(P<0.05). To the end of the experiment, the inhibition effect of the CSC dietary fiber on cholesterol transport was better than that of wheat DF and corn DF(P<0.05).ConclusionsThree kinds of DF, especially DF of cereal-soybean combination, could inhibit cholesterol transport in Caco-2 cell monolayer model.

【Key words】Dietary fiber; Caco-2 cell; Cholesterol

〔中圖分類號〕R39

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1032-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.004

通訊作者：翟成凱(1947-)，男，教授，主要從事營養與健康研究。

基金項目：國家自然科學基金項目(81372986；30471451)

1揚州大學旅游烹飪學院

第一作者：章海風(1977-)，男，講師，在讀博士，主要從事膳食營養與健康研究。