黃精多糖聯合低劑量順鉑對小鼠H22肝癌移植瘤生長的抑制及其抗氧化損傷作用

李超彥　周媛媛　王福青

(漯河醫學高等專科學校基礎醫學部，河南　漯河　462002)

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黃精多糖聯合低劑量順鉑對小鼠H22肝癌移植瘤生長的抑制及其抗氧化損傷作用

李超彥周媛媛王福青

(漯河醫學高等專科學校基礎醫學部，河南漯河462002)

〔摘要〕目的觀察黃精多糖(PSP)聯合低劑量順鉑對小鼠H22肝癌移植瘤生長的影響及其抗氧化損傷作用，并探討其機制。方法72只小鼠右腋皮下注射H22肝癌細胞建立荷瘤模型，隨機分為對照組、PSP小劑量組(10 g/kg)、PSP大劑量組(30 g/kg)、順鉑組(2.5 mg/kg)、PSP小劑量+順鉑組、PSP大劑量+順鉑組；末次給藥24 h后處死小鼠，通過稱重移植瘤的質量，計算抑瘤率；通過稱重肝臟的質量，計算肝臟系數；測定肝組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)的含量；同時觀察肝臟組織學結構變化。結果與對照組比較，順鉑組及PSP+順鉑組均顯著降低移植瘤重(P<0.05或P<0.01)，且隨著PSP劑量增大及與順鉑合用抑瘤率逐漸提高；與對照組比較，順鉑干預后肝臟質量及肝組織勻漿中SOD水平明顯降低(P<0.01)，而MDA含量明顯升高(P<0.01)；與順鉑組比較，PSP聯合順鉑干預后肝臟質量及肝組織勻漿中SOD水平逐漸升高(P<0.05或P<0.01)，且MDA含量降低(P<0.01)。結論黃精多糖與順鉑聯合使用可明顯抑制H22肝癌移植瘤的生長，并能減輕順鉑引發的肝臟氧化損傷。

〔關鍵詞〕黃精多糖；順鉑；肝癌；氧化損傷；超氧化物歧化酶(SOD)；丙二醛(MDA)

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，術后復發和轉移率極高，故化療在肝癌的綜合治療中仍占重要地位〔1〕。順鉑是臨床上常用的周期非特異性重金屬類抗癌藥，對肝癌等各類實體瘤均具有較強的抑制和殺傷作用，但其嚴重的細胞毒作用引發的臟器功能氧化損傷限制了其廣泛應用〔2,3〕。目前，臨床上通常在使用化療藥物的同時配合抗氧化中藥，不僅能起到增效增敏作用，還能減輕化療藥物的毒副反應。黃精多糖(PSP)是黃精水提物的主要有效成分和生物學活性成分之一，研究表明其具有增強免疫力、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化作用〔4,5〕等多種藥理作用。本文以H22荷瘤小鼠為動物模型，觀察PSP聯合低劑量順鉑對小鼠H22移植瘤生長的影響及PSP對順鉑所致肝癌小鼠肝臟氧化損傷的保護作用。

1材料與方法

1.1實驗動物清潔級昆明小鼠，72只，雄性，6~8周齡，體重18~22 g，由鄭州大學醫學院實驗動物中心提供(合格證號醫動字第20110118號)。

1.2細胞株H22肝癌細胞由本校分子醫學實驗中心提供，小鼠腹水傳代。

1.3藥品與試劑PSP，濃度50%，由陜西楊凌東科麥迪森制藥有限公司提供。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所(批號20110307)。順鉑凍干粉(批號11010161，20 mg)，齊魯制藥有限公司生產，臨用前0.9%氯化鈉溶液配制。

1.4儀器721-分光光度計(上海第三分析儀器廠)，超低溫冰箱(美國ThermoForma702)，AU2700全自動生化分析儀(日本奧林巴斯公司)，MSE-25型高速冷凍離心機(上海科學儀器廠)，Leica DMIL倒置顯微鏡(德國萊卡儀器有限公司)。

1.5方法

1.5.1動物模型建立昆明小鼠腹腔接種H22細胞，培養1 w后抽取腹水，顯微鏡下細胞計數器上計數并用無菌生理鹽水調整細胞密度至5×109個/L，每只小鼠右腋皮下注射0.2 ml H22肝癌細胞，制成實體型荷瘤鼠模型。

1.5.2分組及給藥將72只造模成功荷瘤小鼠隨機分為6組，每組12只。對照組(灌胃生理鹽水0.3 ml)；PSP小劑量組(灌胃10 g/kg)；PSP大劑量組(灌胃30 g/kg)；順鉑組(腹腔注射2.5 mg/kg)；PSP小劑量+順鉑組(灌胃PSP 10 g/kg，同時給予順鉑腹腔注射2.5 mg/kg)；PSP大劑量+順鉑組(灌胃PSP 30 g/kg，同時給予順鉑腹腔注射2.5 mg/kg)。以上給藥均為1次/d，連續10 d。

1.5.3一般狀況觀察小鼠接種腫瘤及給藥期間，每天觀察小鼠皮毛、食欲、活動狀況，對刺激的反應及體重變化情況，評價化療毒副反應及生存質量。

1.5.4瘤重及抑瘤率測定末次給藥24 h后，頸椎脫臼法處死小鼠并稱重，完整剝取移植瘤，用濾紙擦拭干凈后電子天平稱重，并依公式計算抑瘤率。

1.5.5肝臟指數測定各組小鼠處死后剪取肝臟并稱重，計算肝臟指數：肝臟質量(g)/體重(g)×100%。

1.5.6肝組織勻漿生化測定計算肝臟系數后剪取0.1 g肝組織，剪碎后加冰生理鹽水研磨成10%組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液置4℃冰箱備測SOD、MDA，SOD、MDA的測定均嚴格按試劑盒說明書進行。

1.5.7組織病理學觀察取小鼠肝臟組織，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，10%甲醛固定，常規石蠟包埋切片，厚度5 μm，行蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡觀察肝臟組織學形態變化。

1.6統計學處理采用SPSS13.0軟件行單因素方差分析。

2結果

2.1荷瘤小鼠一般狀況觀察實驗過程中，通過觀察小鼠精神狀態、活動狀況、對刺激的反應、食欲及消瘦幅度、被毛脫落等指標，評價小鼠的生存質量。結果表明：對照組及PSP各組小鼠生存質量較好，未見明顯的不良反應；順鉑組小鼠生存質量較差，不良反應明顯，出現厭食、腹瀉、精神萎靡、消瘦及脫毛等癥狀；PSP+順鉑聯合用藥組好于單獨順鉑組，不良反應相對較少。實驗結束時，除PSP大劑量組以外的各組小鼠均有死亡，表現為體重明顯下降，排除感染或飼養不當的因素外，推測小鼠死亡原因為自身體質過差引起，但各組小鼠死亡率差異并無統計學意義(P>0.05)。

2.2移植瘤重及抑瘤率接種后1 w內小鼠外觀變化不明顯，1 w后各組均可觸及右腋下瘤塊，對照組小鼠移植瘤生長迅速、局部腫脹壓迫明顯；各藥物治療組小鼠移植瘤生長較對照組緩慢，各組移植瘤重均低于對照組(P<0.05或P<0.01)。各劑量聯合用藥組與單獨用藥組兩兩比較，移植瘤重差異顯著(P<0.01)。見表1。

2.3肝臟質量、肝臟系數及肝組織勻漿生化指標的變化與對照組比較，順鉑組及PSP各劑量與順鉑聯合組肝臟質量明顯下降(P<0.05或P<0.01)，肝臟系數減小；肝臟組織勻漿中SOD明顯下降(P<0.05或P<0.01)，MDA含量明顯升高(P<0.05或P<0.01)；PSP大劑量組可升高肝臟組織勻漿中SOD水平(P<0.05)，降低MDA含量(P<0.05)。與順鉑組比較，PSP各劑量與順鉑聯合組肝臟質量逐漸增大(P<0.05或P<0.01)，肝臟系數變大；肝臟組織勻漿中SOD明顯升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.01)。見表2。

2.4肝組織病理結構變化肝臟HE染色切片顯示，對照組小鼠肝組織結構略疏松，間質有少量炎癥細胞浸潤；與對照組比較，順鉑組小鼠肝組織結構明顯疏松，細胞排列不整齊，胞質豐富且有空泡，部分細胞呈氣球樣變性，門管區出現淋巴細胞浸潤及纖維組織增生；與順鉑組比較，PSP聯合順鉑組小鼠肝損傷有明顯改善，肝細胞氣球樣變及炎性細胞浸潤明顯減少，可見正常肝索結構及纖維化增生減輕。

表1　各組小鼠移植瘤重和抑瘤率比較±s)

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與PSP小劑量組比較：3)P<0.01；與PSP大劑量組比較：4)P<0.01；與順鉑組比較：5)P<0.01

表2　各組小鼠的肝臟質量、肝臟系數和肝組織SOD、MDA的變化

與對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01；與順鉑組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

3討論

據國際癌癥研究中心(IARC)報道，每年肝癌發病率和死亡數占全球肝癌病例的一半以上〔6〕。順鉑是一種廣譜鉑類抗癌劑廣泛應用于臨床，同樣在肝癌的化療中占有重要的地位；其主要通過腫瘤細胞DNA鏈結合，形成交叉連接，抑制DNA、RNA的合成和細胞分裂，從而導致腫瘤細胞分裂障礙而死亡，為周期非特異性腫瘤化療藥物〔2〕。順鉑的抗腫瘤效應具有明顯的劑量依賴性，劑量越大，殺傷腫瘤效應越強〔3〕；但順鉑大劑量應用易引發嚴重的毒副反應〔7〕，主要表現為對肝臟、腎臟等臟器功能的損害〔3,8〕。順鉑致肝臟毒副作用機制尚不明確，可能與其所致脂質過氧化反應增強有關；表現為組織氧化代謝產物MDA水平升高、SOD水平降低，細胞內代謝廢物堆積，引發肝細胞變性、灶性壞死、凋亡，導致急性肝功能障礙等一系列肝臟毒性反應〔7〕。因此增強機體抗氧化功能、降低脂質過氧化反應可能是減小順鉑所致肝臟毒性作用的研究方向之一。

PSP是黃精主要的生物學活性成分，增強免疫力、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化作用等多種藥理作用，近年來研究發現PSP對實體移植具有明顯的抑制作用〔5〕，且對化學性肝功能損傷具有保護作用〔9〕。順鉑的抗腫瘤效應雖有明顯的劑量依賴性，但采用低劑量(通常為最大耐受劑量的1/10~1/3)、長時間連續或高頻率給藥模式，也可產生顯著的抑瘤效果，且毒性反應較小〔10,11〕；鑒于PSP和順鉑的上述特點，在腫瘤化療中聯合用藥理論上是可行。

本研究結果顯示：順鉑組低劑量高頻率順鉑化療雖然取得良好的抑瘤效果，明顯高于PSP各組及對照組，但在整個用藥期間小鼠一般狀況表現不佳，出現厭食、腹瀉、精神萎靡、消瘦及脫毛等癥狀，且對肝臟功能的損害表現也很突出，如肝臟質量、肝臟系數、SOD水平的下降及MDA水平的增高。PSP各劑量單獨用藥時，對移植瘤的生長表現出一定的抑制效果，用藥期間小鼠的一般狀況表現良好，體重增加，且對肝功能損傷呈現出保護作用。PSP與順鉑聯合用藥小鼠對移植瘤的抑瘤效果最佳，瘤重明顯低于對照組及順鉑組，且隨著PSP劑量增大合用的抑瘤效果更佳，抑瘤率最高達86.27%；小鼠用藥期間的生存質量良好，精神狀態、消瘦幅度及脫毛等癥狀尚可；小鼠肝功能的損傷程度遠小于順鉑單獨使用，提示PSP的應用可以減輕順鉑所致的肝功能損傷，表現為肝臟質量、肝臟系數、SOD水平的回升及MDA水平的下降。

PSP與順鉑聯合用藥組的抑瘤率高于順鉑組，提示PSP與順鉑的聯合應用對移植瘤的生長具有不同程度的協同抑制效果，增強了抑瘤能力。順鉑是通過抑制腫瘤細胞DNA、RNA的復制和堿基錯配導致細胞分裂障礙而死亡，達到抑制腫瘤生長的作用〔2〕；PSP組成成分及結構復雜，其抗腫瘤機制目前尚不明確，推測與其增強機體免疫功能、提高機體應激及抗氧化能力等活性有關〔5〕；PSP與低劑量順鉑聯合應用后的協同增效作用及對肝功能的保護作用，其機制可能與順鉑引發腫瘤細胞DNA的損傷、PSP增強機體免疫系統功能及抗氧化能力有關，二者協同抑制了腫瘤細胞的分裂，并誘導了腫瘤細胞的凋亡，其具體機制尚待進一步研究證實。

4參考文獻

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〔2014-11-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1038-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.006

基金項目：河南省教育廳自然科學研究資助項目(2009C310008)

第一作者：李超彥(1981-)，男，講師，碩士，主要從事生理學研究。