CyclinB1、HPV16蛋白在宮頸組織芯片中的表達及臨床意義

鄭　健　王　琨

(內蒙古醫科大學附屬醫院婦產科，內蒙古　呼和浩特　010050)

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CyclinB1、HPV16蛋白在宮頸組織芯片中的表達及臨床意義

鄭健王琨

(內蒙古醫科大學附屬醫院婦產科，內蒙古呼和浩特010050)

〔摘要〕目的探討細胞周期蛋白B1(Cyclin B1)和人乳頭瘤病毒16(HPV16)型蛋白在宮頸癌變過程中的表達及臨床意義。方法采用免疫組化卵白素-生物素-過氧化物酶連接(ABC)法檢測二者在不同病變宮頸組織芯片(TMA)中的表達。結果Cyclin B1、HPV16在宮頸癌中表達高于正常宮頸(P<0.05)。Cyclin B1表達在中分化癌組高于高分化癌組及HPV16表達在鱗癌組高于腺癌組(P<0.05)。Cyclin B1與HPV16表達呈正相關(r=0.46，P<0.01)。結論HPV16感染可能是導致宮頸癌中Cyclin B1表達上調的原因之一。二者協同促進宮頸癌的發生。

〔關鍵詞〕細胞周期蛋白B1；人乳頭瘤病毒16型蛋白；宮頸癌；組織芯片；免疫組織化學

高危型人乳頭瘤病毒(HPV)感染是導致宮頸癌發生的必要因素〔1〕，尤以HPV 16型最常見。盡管通過宮頸液基細胞學檢查和HPV相關檢測使宮頸癌及早發現而死亡率明顯下降，但仍有必要進一步研究其發病機制和演變過程以指導臨床治療。研究發現，細胞周期蛋白B1(Cyclin B1)是細胞周期 G2/M檢測點的正性調控因子，其異常表達與細胞異常增生和一些腫瘤的發生有關〔2〕，其是否與宮頸癌發生有關及其與HPV16的關系如何國內外少有文獻報道。本實驗應用組織芯片(TMA)結合免疫組化卵白素-生物素-過氧化物酶連接(ABC)法檢測Cyclin B1和HPV16在正常宮頸上皮、慢性宮頸炎、宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)和浸潤癌中的表達及相關性。

1材料與方法

1.1研究對象收集2007年1月至2012年1月我院手術切除和活檢的宮頸組織標本172例,其中經病理確診的正常宮頸上皮27例，慢性宮頸炎42例，CIN 13例，浸潤癌90例。術前均未接受任何輔助治療。其中宮頸癌患者的年齡30~80(平均52)歲。按照1995年國際婦產科聯盟頒布的分期標準進行臨床分期：Ⅰ期62例，Ⅱ期21例(均為Ⅱa期)，Ⅰ期、Ⅱ期中盆腔淋巴結轉移3例，Ⅲ期7例。其中80例鱗癌中高分化24例，中分化47例，低分化9例；10例腺癌中高分化1例，中分化9例。13例CIN中CINⅠ5例、CINⅡ3例、CINⅢ5例。

1.2研究方法所有標本經石蠟包埋、切片、HE染色，然后對照HE切片在蠟塊上選定所需的位置，用組織陣列儀抽取組織條作成厚4 μm的連續切片進行免疫組化ABC法染色。鼠抗人Cyclin B1及鼠抗病毒HPV16單克隆抗體和ABC法試劑盒均購自福州邁新生物技術有限公司。染色步驟按試劑盒說明嚴格進行。用磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。由兩位病理科醫師采用雙盲法進行觀察。

1.3結果判定Cyclin B1和HPV16的陽性表達定位于細胞質，均呈棕黃色顆粒物。每張切片隨機觀察5個高倍視野，每個視野計數100個腫瘤細胞。根據染色強度和染色細胞百分率進行評分：無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分，同樣物鏡下陽性細胞百分率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分，兩類分數乘積小于3分為-，滿3分為+，4分為，5分以上為。

1.4統計學方法應用SAS9.0軟件行χ2檢驗及Pearson相關分析。

2結果

2.1組織芯片結果排除制備組織芯片時有1例未取到宮頸鱗癌組織和染色脫片因素，最終兩張芯片可供分析的例數：Cyclin B1為112例，其中正常宮頸上皮6例，慢性宮頸炎30例，CIN 7例，浸潤癌69例(Ⅰ期48例，Ⅱ期17例，均為Ⅱa期，Ⅲ期4例，盆腔淋巴結轉移3例。64例鱗癌和5例腺癌，其中高分化19例，中分化44例，低分化6例，年齡>50歲34例，≤50歲35例)。HPV16為119例，其中正常宮頸上皮24例，慢性宮頸炎22例，CIN 4例，浸潤癌69例(Ⅰ期46例，Ⅱ期17例，均為Ⅱa期，Ⅲ期6例，盆腔淋巴結轉移3例。63例鱗癌和6例腺癌，其中高分化20例，中分化43例，低分化6例，年齡>50歲32例，≤50歲37例)。

2.2Cyclin B1和HPV16在宮頸組織中的表達Cyclin B1的陽性表達定位于細胞質。在正常宮頸和宮頸炎中陽性細胞數量少，在CIN中陽性細胞數增多，著色加深，宮頸癌中陽性細胞數量明顯增加，著色明顯增強。在宮頸癌中的陽性表達率顯著高于正常宮頸和宮頸炎(P<0.05)。在CIN中的陽性表達率較宮頸炎中也顯著增高(P<0.05)。而在其余各組間陽性表達率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。HPV16的陽性表達呈棕黃色，位于細胞質，呈彌漫分布。在宮頸炎、CIN和宮頸癌中的陽性表達率明顯高于正常宮頸(P<0.05)，而在其余各組間陽性表達率比較(P>0.05)。見表1，圖1，圖2。

2.3Cyclin B1和HPV16的表達與宮頸癌臨床病理因素的關系宮頸癌組織中Cyclin B1陽性表達與組織分化程度有關。在中、低分化癌中表達陽性率明顯高于高分化癌，其中高分化癌與中分化癌組之間陽性表達率比較差異有統計學意義(P<0.05)。而其陽性表達與年齡、臨床分期、病理類型及淋巴結轉移等無關(P>0.05)。HPV16表達與病理類型有關，鱗癌中陽性表達率顯著高于腺癌(P<0.05)。而與年齡、臨床分期、組織分化程度、淋巴結轉移等因素無關(P>0.05)。見表2。

表1　不同病變宮頸組織中Cyclin B1、

與宮頸炎比較：1)P<0.05；與正常宮頸比較：2)P<0.05

2.4Cyclin B1和HPV16在宮頸癌組織中表達的相關性對兩張芯片共有的58例宮頸癌組織中兩種蛋白表達行Pearson相關分析：Cyclin B1與HPV16呈明顯正相關(r=0.46,P<0.01)。

表2　Cyclin B1、HPV16蛋白表達與宮頸癌

與高分化比較：1)P<0.05

圖1　Cyclin B1在宮頸癌中表達(ABC,×200)

圖2　HPV16在宮頸癌中表達(ABC,×200)

3討論

細胞周期是通過G1/S,G2/M兩個檢測點進行調控的。兩檢測點失控使本來應停止增殖或生理性凋亡的 DNA受到損傷或 DNA復制發生錯誤的細胞不停地進入細胞周期,因而造成惡性增生〔3〕。研究發現Cyclin B1是細胞周期G2/M檢測點的正性調節因子，也是宮頸癌中的重要調控分子〔4〕，由于其主要合成于S期和G2期，因而其增多可促使細胞不斷地進入S期和G2期進行DNA復制，導致細胞過度增殖而癌變。另一方面，由于Cyclin B1在G2/M期表達最高,其過度表達使細胞周期G2/M轉換時間縮短，進而促進細胞周期的進程，促發癌細胞克服細胞周期G2/M期控節制點進入M期,促進腫瘤的發生與發展〔4〕。本研究發現,隨宮頸病變程度加重,Cyclin B1蛋白陽性表達率呈升高的趨勢。與徐詠蓮等〔5〕的研究結論一致，提示Cyclin B1表達上調在宮頸癌變過程中發揮重要作用，可能是評價宮頸癌變的參考指標。本研究中其在宮頸癌的陽性表達率為71.0%,低于陳麗珍等〔6〕報道的88%，而高于宋敬等〔7〕報道的52.63%。本文提示Cyclin B1異常表達可能宮頸癌發生中的早期事件，這是有助于宮頸癌的早期診斷。這與樊素珍等〔8〕在卵巢癌中得出的結論相似。本研究說明Cyclin B1表達與分化程度有關,分化越低,表達越強，這也與陳麗珍等〔6〕的研究結論一致。

HPV是小型雙鏈環狀DNA病毒,目前已發現100多型。其中高危型HPV16/18是宮頸癌的重要致病因素。HPV高危型病毒能使宮頸細胞產生變異，其E6和E7蛋白通過與Rb蛋白作用，促進細胞增殖，而E6蛋白能對抗p53的基因修復功能，使宮頸細胞發展為癌前病變〔9〕。本研究中HPV16蛋白在宮頸癌的陽性表達率為85.5%,高于邢軍等〔10〕報道的 75%。這可能與檢測標本均為已標記的典型病變區域有關。本文結果表明HPV16感染的累積是引起細胞的轉化導致宮頸癌發生的一個重要因素，提示HPV16參與宮頸癌的發生并起重要作用。對HPV16的檢測有助于宮頸癌篩查診斷。本研究還發現HPV16蛋白在宮頸鱗癌中較腺癌中陽性表達率高。與李惠新等〔11〕研究認為的HPV16主要導致宮頸鱗癌發生結論一致。也與李宏等〔12〕研究認為的HPV16為宮頸鱗癌主導感染亞型,HPV18為宮頸腺癌主要感染亞型的結論一致。此外,本研究HPV16感染與宮頸癌的年齡、臨床分期、組織分化及淋巴結轉移無關，提示HPV16持續感染只是導致宮頸癌變的一個主要因素,感染后可引起一系列其他基因的改變而促進宮頸癌的發展進程。

HPV是宮頸癌的主要致病因素,但不是唯一致病因素。HPV對細胞的致癌作用需要一個漫長的積累過程,這種積累可能是細胞同時受其他因子損傷的積累過程,也可能是細胞分裂過程中錯誤事件的積累。HPV感染的細胞發生惡變需要其他因子的協同作用。本研究顯示HPV16與Cyclin B1表達存在正相關，HPV16感染可能是導致Cyclin B1表達上調的原因之一。由于Cyclin B1是細胞周期G2/M檢測點的正性調節因子，HPV16感染后,其E1、E4蛋白可能通過上調Cyclin B1表達，促使細胞不斷地進入G2期進行DNA復制，導致宮頸上皮細胞異常復制、過度增殖而癌變。這已在Davy等〔13〕的研究中得到證實。因此認為，本研究認為，HPV16與Cyclin B1在宮頸癌變中起協同作用。這與Cho等〔14〕用免疫組化和PCR方法研究認為的Cyclin B1表達與HPV16感染相關的結論一致。

綜上，Cyclin B1和HPV16在宮頸癌中的異常表達說明二者均參與了宮頸上皮細胞的癌變。HPV16的持續感染可能是宮頸癌變的起因，而Cyclin B1高表達則通過加快細胞周期的進程而促進具有癌變潛能的細胞被鎖定在細胞周期中不斷地進行DNA的異常復制、增殖。二者在宮頸癌變的不同階段扮演者不同的角色，協同促進宮頸癌的發生。

4參考文獻

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11李惠新，雷靜.HPV16E6的表達與宮頸鱗癌發病的相關性研究〔J〕.醫學綜述，2011;17(16):2507-8.

12李宏，張留苗.人乳頭瘤病毒感染亞型與宮頸腫瘤關系的臨床分析〔J〕.中國婦幼保健，2012;27(14)：2105-7.

13Davy CE，Jackson DJ，Raj K，etal.Human papillomavirus type 16 E1 E4-induced G2 arrest is associated with cytoplasmic retention of active Cdk1/cyclin B1 complexes〔J〕.J Virol,2005;79(7):3998-4011.

14Cho NH,Lim SY,Kim YT,etal.G2 checkpoint in uterine cervical cancer with HPV 16 E6 according to p53 polymorphism and its screening value〔J〕.Gynecol Oncol,2003;90(1):15-22.

〔2014-07-12修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

〔中圖分類號〕R737.33

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1050-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.012

第一作者：鄭健(1973-)，男，碩士，副主任醫師，碩士生導師，主要從事婦科腫瘤研究。