甘氨酸對(duì)重癥急性胰腺炎肺組織中髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-1 mRNA及高遷移率族蛋白-1表達(dá)的影響及臨床意義

朱　勇　崔建嬌　張明智　王　萍

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院ICU，遼寧　錦州　121000)

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甘氨酸對(duì)重癥急性胰腺炎肺組織中髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-1 mRNA及高遷移率族蛋白-1表達(dá)的影響及臨床意義

朱勇崔建嬌1張明智2王萍3

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院ICU，遼寧錦州121000)

〔摘要〕目的探討甘氨酸對(duì)重癥急性胰腺炎(SAP)肺組織中髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體(TREM)-1與高遷移率族蛋白(HMGB)-1表達(dá)的影響及臨床意義。方法將81只SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、SAP組和甘氨酸組，每組27只。對(duì)照組常規(guī)開腹后僅移動(dòng)腸管，SAP組常規(guī)開腹后進(jìn)行胰管穿刺并注入5%牛磺膽酸鈉溶液建立SAP大鼠模型，甘氨酸組在建立SAP大鼠模型前3、6 h分別從尾部靜脈注入甘氨酸。在建模成功后的第6、12、24 h從三組大鼠中隨機(jī)選擇9只進(jìn)行剖腹獲取完整肺部組織以測(cè)定TREM-1 mRNA和HMGB-1水平。結(jié)果SAP組TREM-1 mRNA的表達(dá)水平逐漸上升，且6、12、24 h的TREM-1 mRNA表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組和甘氨酸組(P<0.05)，12 h和24 h的HMGB-1表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組和甘氨酸組(P<0.05)；而甘氨酸組6、12、24 h的TREM-1mRNA和HMGB-1的表達(dá)水平均與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論甘氨酸對(duì)SAP肺組織具有一定的保護(hù)作用，可顯著降低肺組織中TREM-1 mRNA和HMGB-1的表達(dá)。

〔關(guān)鍵詞〕甘氨酸；重癥急性胰腺炎；肺組織；TREM-1mRNA；HMGB-1

重癥急性胰腺炎(SAP)是急性胰腺炎中的一種特殊類型，并發(fā)癥多、病情險(xiǎn)惡、病死率高。SAP常伴有其他器官功能改變，其中肺組織損傷最為常見，發(fā)生率高達(dá)60%以上，成為SAP患者早期死亡的主要原因〔1~3〕。研究發(fā)現(xiàn)，SAP肺部損傷程度與肺組織中髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體(TREM)-1與高遷移率族蛋白(HMGB)-1的表達(dá)密切相關(guān)〔4，5〕。本研究旨在探究甘氨酸對(duì)SAP所引起的肺部損傷的保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1材料SD大鼠81只(遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室)，甘氨酸，牛磺膽酸鈉，cDNA合成試劑盒(安捷倫科技有限公司)，HMGB-1 ELISA試劑盒(美國(guó)R&D公司)，PCR試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，引物均由美國(guó)Invitrogen公司合成后提供。

1.2鼠模型制備方法將SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、SAP組和甘氨酸組各27只。對(duì)照組大鼠進(jìn)行常規(guī)開腹手術(shù)，但不進(jìn)行胰管穿刺和牛磺膽酸鈉溶液注射，僅移動(dòng)腸管后關(guān)腹。SAP組大鼠僅建立SAP大鼠模型。甘氨酸組大鼠在建模前3、6 h分別從尾部靜脈注入甘氨酸(0.1 ml/100 g)，之后給予常規(guī)建模。SAP大鼠模型〔6，7〕采用5%牛磺膽酸鈉對(duì)胰膽管進(jìn)行逆行注射建立：建模前大鼠禁食半天，飲水自由，建模時(shí)先腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，常規(guī)消毒、備皮、鋪巾，從上腹正中切口處進(jìn)入腹腔，用動(dòng)脈夾關(guān)閉胰管近腸端和近肝門端血管。準(zhǔn)備就緒后，用24G的頭皮針進(jìn)行胰管穿刺，穿刺成功后注入5%牛磺膽酸鈉溶液(1.5 ml/kg)，維持0.2 ml/min的速度注射，注射結(jié)束后10 min去除動(dòng)脈夾。觀察大鼠胰腺病變情況，若胰腺發(fā)生水腫并伴有少數(shù)出血灶，則說(shuō)明已成功建立SAP動(dòng)物模型，此時(shí)可將注射針退出，按摩穿刺孔后給予創(chuàng)面封閉膠封閉胰腺穿刺孔，逐層關(guān)腹。若胰腺尚未出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，則說(shuō)明未成功建立模型，還需再進(jìn)行一次5%牛磺膽酸鈉溶液注射的過(guò)程。

1.3檢測(cè)指標(biāo)分別在建模成功后的第6、12、24 h從三組大鼠中隨機(jī)選擇9只進(jìn)行剖腹獲取完整肺部組織，進(jìn)而測(cè)定TREM-1 mRNA和HMGB-1水平。

1.3.1肺部組織TREM-1 mRNA檢測(cè)〔8〕以β-actin作為內(nèi)參，利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)進(jìn)行檢測(cè)，TREM-1引物序列為：上游序列5′-TGTGCGTGTTCTTTGTCT-3′、下游序列5′-TGGTAATAAG2GATGGGAC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度450 bp。反應(yīng)完成后將擴(kuò)增產(chǎn)物置于1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描并保存電泳結(jié)果，計(jì)算樣本與內(nèi)參的積分吸光度比值，該比值即為TREM-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2肺部組織HMGB-1檢測(cè)采用ELISA方法，利用HMGB-1 ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠肺部組織中HMGB-1水平，檢測(cè)過(guò)程完全按照HMGB-1 ELISA試劑盒的操作步驟進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1三組TREM-1 mRNA的表達(dá)水平比較SAP組TREM-1 mRNA的表達(dá)水平逐漸上升，且6、12、24 h的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組和甘氨酸組(P<0.05)；甘氨酸組6、12、24 h TREM-1 mRNA表達(dá)水平較為平穩(wěn)，與對(duì)照組相比雖有所升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2三組間HMGB-1的表達(dá)水平比較對(duì)照組和甘氨酸組HMGB-1的表達(dá)水平在6、12、24 h三個(gè)時(shí)點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，SAP組在6 h時(shí)點(diǎn)與對(duì)照組和甘氨酸組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在12 h和24 h時(shí)點(diǎn)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和甘氨酸組(P<0.05)。見表2。

表1　三組大鼠肺組織TREM-1 mRNA

與SAP組相比:1)P<0.05;下表同

表2　大鼠肺組織HMGB-1的表達(dá)水平

3討論

肺部損傷是SAP患者死亡的重要原因之一，早期預(yù)防和及時(shí)治療肺部損傷對(duì)降低SAP患者病死率、提高患者生存質(zhì)量有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，SAP肺部損傷與腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-β等多種炎性因子有關(guān)〔9，10〕，這些致病因子可直接損傷肺血管內(nèi)皮和(或)肺泡上皮，導(dǎo)致肺組織出現(xiàn)大量白細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫，肺部組織損傷后通常可出現(xiàn)通氣和(或)換氣功能障礙，影響患者的正常呼吸功能，病情嚴(yán)重者后期還可出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征。隨著臨床基因?qū)W的不斷發(fā)展，肺組織內(nèi)細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1、TREM-1、TREM-2、HMGB-1等與SAP肺部損傷有關(guān)的基因表達(dá)也不斷被發(fā)現(xiàn)，其中TREM-1和HMGB-1與SAP肺部損傷關(guān)系的研究最為深入。TREM-1是免疫球蛋白超家族的成員之一，是一種在中性粒細(xì)胞和(或)部分單核細(xì)胞表面選擇性表達(dá)的跨膜受體，可通過(guò)跨膜調(diào)節(jié)蛋白誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞和因子的產(chǎn)生而引發(fā)炎癥反應(yīng)并形成瀑布效應(yīng)，加重器官、組織損傷〔11〕。HMGB-1是一種晚期炎癥介質(zhì)，可維持和延長(zhǎng)機(jī)體炎癥反應(yīng)，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)HMGB-1還是決定細(xì)胞做出壞死或凋亡選擇的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)〔12〕。

本研究提示甘氨酸可下調(diào)肺部組織中TREM-1 mRNA和HMGB-1的表達(dá)，減少兩種因子對(duì)肺部組織的損傷。其可能機(jī)制為：①甘氨酸可維持細(xì)胞膜穩(wěn)定，避免肺部細(xì)胞蜂窩狀改變和胞質(zhì)泄漏，從而減少了細(xì)胞損害，導(dǎo)致?lián)p傷對(duì)TREM-1 mRNA和HMGB-1的表達(dá)刺激較弱；②甘氨酸通過(guò)拮抗內(nèi)毒素下調(diào)TREM-1 mRNA和HMGB-1的表達(dá)〔13，14〕。

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〔2015-08-03修回〕

(編輯滕欣航)

〔中圖分類號(hào)〕R576

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)05-1055-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.014

通訊作者：王萍(1968-)，女，碩士，教授，主要從事臨床醫(yī)學(xué)研究。

1遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)中心

2遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院消化科3遼寧醫(yī)學(xué)院

第一作者：朱勇(1971-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事重癥感染與呼吸衰竭方面的研究。