T肽對(duì)樹(shù)突細(xì)胞的協(xié)同作用及其對(duì)腎癌細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)和免疫微環(huán)境的影響

楊旭初　王懷璋　張新峰　劉懷民

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院　河南省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤內(nèi)科，河南　鄭州　450008)

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T肽對(duì)樹(shù)突細(xì)胞的協(xié)同作用及其對(duì)腎癌細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)和免疫微環(huán)境的影響

楊旭初王懷璋張新峰劉懷民

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院河南省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤內(nèi)科，河南鄭州450008)

〔摘要〕目的探究T肽對(duì)樹(shù)突細(xì)胞(DC)的協(xié)同作用及其對(duì)腎癌細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)和免疫微環(huán)境的影響。方法(1)將人DC的培養(yǎng)皿分為3組：A組人DC的培養(yǎng)皿加入生理鹽水100 μl，B組人DC的培養(yǎng)皿加入T肽50 μg/100 μl，C組人DC的培養(yǎng)皿加入脂多糖(LPS)50 μg/100 μl；使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC成熟度，并觀察DC表面共刺激分子表達(dá)。(2)將人DC的培養(yǎng)皿分為兩組：D組人DC的培養(yǎng)皿加入生理鹽水100 μl，F(xiàn)組人DC的培養(yǎng)皿加入T肽50 μg/100 μl；觀察人DC分泌IL-12b的情況。(3)將人腎癌細(xì)胞的培養(yǎng)皿分為2組：E組人腎癌細(xì)胞的培養(yǎng)皿加入生理鹽水100 μl，F(xiàn)組人腎癌細(xì)胞加入人DC懸液100 μl；D組人腎癌細(xì)胞加入T肽50 μg/ 100 μl和人DC懸液100 μl；觀察T肽協(xié)同DC對(duì)腎癌細(xì)胞的凋亡率，并且檢測(cè)趨化因子CCL2、CCL5、CCL20、CCL22和CCL27的表達(dá)。結(jié)果T肽促進(jìn)DC的成熟，促進(jìn)其表面共刺激分子表達(dá)水平上調(diào)；T肽可促進(jìn)DC分泌IL-12b； T肽聯(lián)合DC組對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義(P<0.05)；DC組和T肽聯(lián)合DC組對(duì)腎癌細(xì)胞免疫微環(huán)境的影響明顯，而且T肽聯(lián)合DC組對(duì)腎癌細(xì)胞免疫微環(huán)境的影響最明顯(P<0.05)。結(jié)論T肽對(duì)DC具有協(xié)同作用，且可增強(qiáng)DC的抗腫瘤效應(yīng)和對(duì)免疫微環(huán)境的影響。

〔關(guān)鍵詞〕T肽；樹(shù)突細(xì)胞；腎癌腫瘤細(xì)胞株；殺滅效果；微環(huán)境

T肽是一種適用于多種晚期惡性實(shí)體瘤術(shù)后使用的抗腫瘤藥物，特點(diǎn)是以提高腫瘤患者自身免疫機(jī)能來(lái)達(dá)到抗腫瘤的目的，是一個(gè)高效、低毒、廣譜、藥物費(fèi)用為廣大患者可接受的創(chuàng)新型抗腫瘤藥物〔1，2〕。樹(shù)突細(xì)胞(DC)注入體內(nèi)后可以刺激體內(nèi)的腫瘤殺傷性淋巴細(xì)胞增殖，發(fā)揮腫瘤殺傷作用〔3〕。在臨床開(kāi)展的腫瘤抗原致敏DC、荷載腫瘤抗原DC誘導(dǎo)的腫瘤特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞的免疫療法治療腎癌，已經(jīng)獲得中位生存期延長(zhǎng)的良好療效〔4，5〕。在對(duì)腎癌治療中出現(xiàn)全身轉(zhuǎn)移的患者進(jìn)行免疫治療后，亦獲得了3年以上生存和全身多處轉(zhuǎn)移灶消退的療效。盡管如此，并非所有的患者均能獲得良好療效。本文探究T肽對(duì)DC的協(xié)同作用及其對(duì)腎癌細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)和免疫微環(huán)境的影響。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)資料T肽純品及人DC懸液(北京，解放軍總醫(yī)院多肽實(shí)驗(yàn)室)；人腎癌細(xì)胞株(美國(guó)ATCC公司)；FACSArill型高速分選流式細(xì)胞儀(美國(guó) BD公司)；Freedom EVO 75 全自動(dòng)酶聯(lián)免疫吸附分析儀(瑞士Tecan公司)。

1.2人外周血DC的培養(yǎng)新鮮外周血50 ml經(jīng)淋巴分離液梯度離心，取界面層單個(gè)核細(xì)胞，用PRMI 1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，3 000 r/min離心15 min(r=10 cm)，洗滌細(xì)胞3次，貼壁2 h后，貼壁細(xì)胞加入GM-CSF 1 000U/ml和IL-4 100 U/ml，每3 d換液1次。

1.3腫瘤細(xì)胞裂解物的制備離心收集腫瘤細(xì)胞，沉淀利用PBS洗2次后，溶于1 ml PRMI 1640，經(jīng)超聲波粉碎后，至倒置顯微鏡觀察到95%細(xì)胞破碎、溶解，將勻漿倒入離心管中，100 000 r/min超速離心90 min(r=15 cm)，吸取上清即為腫瘤細(xì)胞裂解物，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4DC抗原負(fù)載將腫瘤細(xì)胞裂解物作為腫瘤抗原，在DC培養(yǎng)的第5天加入腫瘤細(xì)胞裂解物20 μg負(fù)載1×106DC，于第8天收集的懸浮細(xì)胞即為負(fù)載后的成熟DC，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC細(xì)胞的免疫表型。

1.5研究方案(1)將人DC的培養(yǎng)皿分為3組，生理鹽水組：人DC的培養(yǎng)皿加入生理鹽水100 μl；脂多糖(LPS)組：培養(yǎng)皿中加入LPS 50 μg/100 μl；T肽組：培養(yǎng)皿中加入T肽50 μg/100 μl。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC成熟度，并觀察DC表面共刺激分子和白細(xì)胞介素(IL)-12的表達(dá)；在DC培養(yǎng)的第6、9和12 天，取少許各組上清液，用ELISA方法測(cè)各組血清中IL-12，步驟參照 IL-12檢測(cè)盒說(shuō)明書(shū)。(2)將人腎癌細(xì)胞的培養(yǎng)皿分為3組，空白對(duì)照組：人腎癌細(xì)胞的培養(yǎng)皿加入生理鹽水100 μl；DC組：人腎癌細(xì)胞加入人DC懸液100 μl；協(xié)同治療組人腎癌細(xì)胞加入T肽50 μg/100 μl和人DC懸液100 μl。使用高速分選流式細(xì)胞儀觀察T肽協(xié)同DC對(duì)腎癌細(xì)胞的凋亡率，并且通過(guò)ELISA對(duì)常見(jiàn)趨化因子CCL2、CCL5、CCL20、CCL22和CCL27在腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，分析其腫瘤細(xì)胞免疫微環(huán)境的變化趨勢(shì)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件進(jìn)行χ2及方差分析。

2結(jié)果

2.1T肽對(duì)DC成熟度和表面共刺激分子表達(dá)的影響T肽促進(jìn)人DC的成熟，促進(jìn)其表面共刺激分子(CD80、CD11c)表達(dá)水平上調(diào)(表1)。

2.2T肽對(duì)DC分泌IL-12b的影響T肽可促進(jìn)人DC分泌IL-12b，有助于殺傷腫瘤細(xì)胞(表2)。

2.3T肽協(xié)同DC對(duì)腎癌細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)DC組和T肽聯(lián)合DC組對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用明顯，而且T肽聯(lián)合DC組對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)(P<0.05)(表3)。

表1　T肽對(duì)DC成熟度和表面共刺激分子表達(dá)的

表2　T肽對(duì)DC分泌IL-12b的影響(n=25，熒光強(qiáng)度，

2.4T肽協(xié)同DC對(duì)腎癌細(xì)胞免疫微環(huán)境的影響DC組和 T肽聯(lián)合DC組對(duì)腎癌細(xì)胞免疫微環(huán)境的影響明顯，而且T肽聯(lián)合DC組對(duì)腎癌細(xì)胞免疫微環(huán)境的影響最明顯(P<0.05)(表4)。

表3　T肽協(xié)同DC對(duì)腎癌細(xì)胞凋亡率的影響

表4　T肽協(xié)同DC對(duì)腎癌細(xì)胞免疫微環(huán)境的影響±s)

3討論

由于腫瘤抗原性較弱，患者 DC 可能存在低能或失能，因此往往難以激發(fā)出自身強(qiáng)有力的腫瘤特異性免疫。如何在促進(jìn) DC 攝取、消化和遞呈抗原方面優(yōu)化條件，制備出優(yōu)良的 DC 疫苗以打破腫瘤免疫耐受，是增強(qiáng)腫瘤特異性免疫能力的重要途徑之一。目前，DC負(fù)載抗原后常以腫瘤壞死因子(TNF)-α作為促成熟劑，但需要探索效率更高的促進(jìn) DC 成熟及活化的制劑。促吞噬素(Tuftsin) 是一種由人體脾臟分泌的多肽類(lèi)物質(zhì)，通過(guò)與細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，可促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬作用來(lái)達(dá)到殺傷腫瘤的效果，但對(duì)于 DC臨床 的作用尚不明確，有待進(jìn)一步的研究。

T肽是以天然四肽Tuftsin為母體進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造獲得的一種新衍生物，它不僅保留了Tuftsin的促吞噬和抗腫瘤的生物活性，而且大大提高了抗酶解能力，延長(zhǎng)了體內(nèi)半衰期〔6，7〕。T肽是一種適用于多種晚期惡性實(shí)體瘤術(shù)后使用的抗腫瘤藥物〔8~10〕。T肽還是DC的激活劑，可促進(jìn)DC的成熟，其表面共刺激分子表達(dá)水平更高，可能增強(qiáng)DC的抗原遞呈功能。醫(yī)藥領(lǐng)域中還未曾有肽類(lèi)及免疫增強(qiáng)劑成為臨床治療腫瘤的藥物，T肽有望突破這一局限成為第一個(gè)治療惡性腫瘤的多肽類(lèi)藥物。T肽可以顯著增強(qiáng) DC 的吞噬功能，有利于 DC 功能的表達(dá)，分泌更多的正向免疫調(diào)節(jié)因子；腫瘤抗原多肽聯(lián)合TNF-α、T肽致敏DC誘導(dǎo)的CTL在體外的殺腫瘤活性顯著優(yōu)于其余各組；腫瘤抗原多肽聯(lián)合TNF-α、T肽致敏DC誘導(dǎo)的CTL治療荷人結(jié)腸癌裸鼠有顯著療效，相對(duì)于現(xiàn)在臨床應(yīng)用的DC 治療方法抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果更好。

腫瘤細(xì)胞無(wú)法被T細(xì)胞識(shí)別、殺傷是由于荷瘤宿主的DC功能有缺陷，無(wú)法有效提呈腫瘤抗原所致，腫瘤患者存在DC數(shù)量減少及功能缺陷的特點(diǎn)〔11，12〕。腫瘤患者外周血DC的MHC-Ⅱ類(lèi)分子表達(dá)水平比正常對(duì)照組明顯下降。因此，MHC-Ⅱ類(lèi)分子及某些共刺激分子的低表達(dá)可能是DC無(wú)法有效激發(fā)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)的原因。免疫激活劑處理可提高腫瘤的免疫原性，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤組織負(fù)載的DC抗腫瘤免疫效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，T肽可促進(jìn)DC的成熟，其表面共刺激分子表達(dá)水平更高，可能增強(qiáng)DC的抗原遞呈功能。同時(shí)，T肽可促進(jìn)DC分泌IL-12b，有助于殺傷腫瘤細(xì)胞。T肽促進(jìn)DC的成熟，其表面共刺激分子表達(dá)水平更高。

本研究發(fā)現(xiàn)，DC組和 T肽聯(lián)合DC組對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用明顯，而且T肽聯(lián)合DC組對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)。此外，DC組和T肽聯(lián)合DC組對(duì)腎癌細(xì)胞免疫微環(huán)境的影響明顯，而且T肽聯(lián)合DC組對(duì)腎癌細(xì)胞免疫微環(huán)境的影響最明顯。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，T肽對(duì)DC具有協(xié)同作用，且可增強(qiáng)DC的抗腫瘤效應(yīng)和對(duì)免疫微環(huán)境的影響，即T肽不但是一種抗腫瘤藥物，還是DC的激活劑。

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〔2016-01-26修回〕

(編輯曲莉)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R73-35+4

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)05-1057-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.015

通訊作者：劉懷民(1970-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事惡性腫瘤綜合治療研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81473638)

第一作者：楊旭初(1985-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合腫瘤學(xué)研究。