艾拉莫得治療大鼠膠原誘導性關節炎的療效及可能機制

鄒惠美　成沛玉　王　蓉

(南華大學護理學院，湖南　衡陽　421001)

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艾拉莫得治療大鼠膠原誘導性關節炎的療效及可能機制

鄒惠美成沛玉1王蓉

(南華大學護理學院，湖南衡陽421001)

〔摘要〕目的探討艾拉莫得(T-614)對膠原誘導關節炎(CIA)模型大鼠的治療作用及可能機制。 方法通過牛Ⅱ型膠原(CⅡ)和不完全弗氏佐劑混合的膠原乳劑免疫大鼠，建立CIA模型，CIA大鼠隨機被分為模型組、甲氨蝶呤(MTX)組、T-614高劑量組和T-614低劑量治療組。其中藥物干預組大鼠分別用甲氨蝶呤、高劑量T-614和低劑量T-614連續干預3 w。關節炎指數(AI) 評分評價大鼠關節炎發病程度，HE染色觀察大鼠踝關節組織病理學改變，應用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測大鼠血清中抗CⅡ-IgG抗體及其兩種亞型IgG1、IgG2a的抗體滴度，ELISA試劑盒檢測血清白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α和干擾素(IFN)-γ水平。 結果藥物干預3 w后，與模型組相比，T-614高劑量組的AI評分、病理學評分、IgG及其亞型IgG1、IgG2a的抗體滴度和3種細胞因子含量均降低(P<0.05)。 結論T-614能夠積極改善CIA大鼠關節炎的癥狀，并可能通過降低大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IFN-γ等炎性細胞因子和IgG抗體的表達而發揮抑制關節炎癥病程發展的作用。

〔關鍵詞〕艾拉莫得；膠原性誘導關節炎；抗CⅡ-IgG抗體；炎性細胞因子

類風濕關節炎(RA)可導致關節畸形嚴重影響患者的生活質量〔1〕。RA的基本病理特征是炎癥細胞浸潤、滑膜細胞大量增殖和血管翳的生成，并最終引起關節軟骨和骨質的破壞。而T淋巴細胞的活化及其炎性細胞因子表達的增加在RA的疾病發展過程中起到了非常重要的作用〔2〕。艾拉莫德(T-614)是全球第一個具有我國完全自主知識產權的抗風濕新藥，目前該藥已于2011年經國家批準上市并在臨床上用于治療RA且取得了良好的效果〔3〕。T-614在治療RA過程中所發揮藥理作用的相關實驗研究報道甚少，不同劑量的T-614對抑制RA炎癥反應的機制仍不明確。本實驗擬通過觀察T-614對膠原活導關節炎(CIA)大鼠的治療作用，探究其對CIA大鼠淋巴細胞活化及其炎性細胞因子表達影響的作用機制。

1材料和方法

1.1實驗動物SPF級雌性Wistar成年大鼠50只，體重(170±10)g。飼養條件：SPF級動物房，光照/黑暗:12 h/12 h，標準飼料，清潔飲水。動物適應性飼養1 w。

1.2主要試劑及藥物牛Ⅱ型膠原(CⅡ，Sigma公司)，不完全弗氏佐劑(Sigma公司)；甲氨蝶呤片(上海信誼藥廠有限公司)，艾拉莫得片(南京先聲藥業有限公司)；抗大鼠免疫球蛋白G(IgG) 抗體及抗大鼠IgG1、IgG2a 抗體(Bethyl公司)；白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α及γ干擾素(IFN-γ) 的ELISA試劑盒(Bender-MedSystems公司，奧地利)。

1.3造模與分組50只大鼠預先制備CIA模型。以牛CⅡ與不完全弗氏佐劑制備成終濃度為2 g/L的免疫混合乳劑，于每只大鼠尾根部皮內注射免疫乳劑150 μl，同樣的方法于7 d后加強免疫1次。初次免疫后第10天起每天觀察造模大鼠關節炎的發病情況，并行關節炎指數(AI)評分。共有43只造模大鼠第1次AI評分≥5分，顯示造模成功，從其中選取40只隨機分成模型組、MTX組、T-614高劑量組和T-614低劑量組，每組各10只。初次免疫第14天起開始灌胃，MTX組給予MTX灌胃(2.5 mg·kg-1·w-1)，T-614高劑量組給予10 mg·kg-1·d-1T-614灌胃，T-614低劑量組給予5 mg·kg-1·d-1T-614灌胃，模型組給予生理鹽水作為對照。灌胃連續3 w，直至初次免疫第34天。

1.4AI評分初次免疫后第10天起對造模大鼠關節炎進行評分。評分標準依照AI 0～4級評分法〔3〕。于初次免疫第10天起直至第34天每4天記錄1次關節炎評分。

1.5病理形態學觀察及評分各組大鼠于灌胃3 w后(初次免疫后第34天)取血后處死，取大鼠踝關節置于4%多聚甲醛中固定16 h，10%乙二胺四乙酸溶液中脫鈣，脫水、包埋，切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察關節組織病理變化。病理評分標準參照Tsubaki等〔4〕于2005年提出的評分方法。

1.6血清中抗CⅡ-IgG及其亞型抗體和炎性細胞因子的檢測分離大鼠血清，應用ELISA法檢測血清中抗CⅡ-IgG及其兩種亞型IgG1、IgG2a的抗體滴度，在450 nm波長下測定光密度值；分別應用IL-1β、TNF-α和IFN-γ的ELISA試劑盒對大鼠血清中的IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平進行檢測，操作過程嚴格按照說明書執行。

1.7統計學分析采用SPSS16.0軟件行單因素方差分析。

2結果

2.1各組大鼠體重變化及AI評分實驗結束時模型組、MTX組、T-614高劑量組和T-614低劑量組大鼠體重比免疫前分別增加了(7.8±5.1) g、(19.8±7.3)g、(20.5±7.9) g和(18.1±6.7) g ；雖然各治療組的大鼠體重增加都大于模型組，但差異均沒有統計學意義(P>0.05)。實驗結束時模型組、MTX組、T-614高劑量組和T-614低劑量組大鼠AI評分分別為(7.600±1.694)、(3.700±1.473)、(3.100±0.548)、(3.900±1.176)，與模型組比較，其他各組AI評分均顯著降低(P<0.05)。初次免疫后第10天、14天、18天、22天、26天、30天、34天關節炎評分，見表1。

表1　各組CIA大鼠關節炎評分

與模型組比較:1)P<0.05，下表同

2.2各組大鼠關節病理形態改變及病理評分HE染色結果顯示模型組有大量炎癥細胞浸潤，同時伴有滑膜細胞增生和血管翳生成，部分軟骨及骨質有明顯破壞。而MTX組和T-614各治療組炎癥細胞浸潤和滑膜細胞增生較輕，少見血管翳生成，軟骨和骨質破壞不明顯。與模型組相比，T-614高劑量組可明顯抑制病變的發展(P<0.05)。見圖1和表2。

圖1　各組大鼠關節病理學改變(HE)

組別總分滑膜增生炎細胞浸潤新生血管模型組0.742±0.0790.482±0.0020.197±0.0530.281±0.159MTX組0.653±0.1291)0.287±0.1491)0.171±0.0280.218±0.1521)T-614高劑量組0.581±0.1171)0.226±0.1211)0.049±0.0061)0.203±0.1391)T-614低劑量組0.657±0.1201)0.389±0.1841)0.051±0.0211)0.278±0.193

2.3各組大鼠血清中抗CⅡIgG及其亞型IgG1、IgG2a水平在模型組、MTX組、T-614高劑量組和T-614低劑量組大鼠血清中，抗CⅡIgG滴度的光密度值分別為1.82±0.84、1.32±0.57、1.17±0.63和1.59±0.93，雖然T-614低劑量組與模型組相比較低，但各組間差異無統計學意義，而T-614高劑量組則明顯低于模型組(P<0.05)；亞型IgG1分別為0.36±0.17、0.23±0.11、0.14±0.03及0.33±0.14，T-614高劑量組相對于模型組明顯降低(P<0.05)，而T-614低劑量組和模型組之間沒有明顯差異；亞型IgG2a分別為0.87±0.63、0.51±0.34、0.43±0.31 和0.46± 0.28，相比模型組，T-614高劑量組和T-614低劑量組都明顯降低(P<0.05)。

2.4各組大鼠血清細胞因子水平通過藥物干預后，MTX組、T-614高劑量組和T-614低劑量組的血清IL-1β、TNF-α和IFN-γ含量均明顯低于模型組(P<0.05)。見表3。

表3　各組大鼠血清IL-1β、TNF-α和

3討論

RA是自身免疫性疾病的典型代表之一，T細胞異常活化，分化為不同功能的亞群，產生大量炎性細胞因子，導致關節損害〔5，6〕。IL-1β、TNF-α和IFN-γ是RA致病的關鍵因子，與RA病程進展密切相關〔7〕。

T-614是國家食品藥品監督管理局臨床批準的Ⅰ類新藥，于2011年8月獲得中國食品藥品監督管理局批準，用于治療成人活動性RA〔8〕。在T-614的相關基礎研究中發現，T-614對脂多糖(LPS)誘導大鼠肺泡巨噬細胞TNF-α等炎性因子水平的上調有顯著抑制作用〔9〕。本結果顯示兩種不同劑量T-614治療組中血清中IL- 1β、TNF-α和IFN-γ的水平均顯著降低，其中高劑量組更顯著。高劑量T-614可明顯減輕關節的炎癥細胞浸潤、滑膜細胞增殖、血管翳生成和骨質破壞，可見T-614對CIA病程進展的抑制作用。

同時RA是一種T細胞活化異常的自身免疫病，其中抗CⅡ抗體IgG兩種亞型的表達就與Th1、Th2有著非常緊密的聯系。Th1可以促進IgG2a的產生，而Th2則促進IgG1的產生〔10〕。艾拉莫德不僅能夠抑制載脂蛋白Ⅱ抗體水平而且還能分別調控免疫球蛋白亞群的水平，并呈劑量依賴性〔11〕。本研究結果說明T-614可以抑制T細胞免疫反應從而發揮治療作用。而低劑量的T-614只能影響IgG2a的水平，這提示IgG2a可能在T-614對CIA的抑制機制中發揮著中心作用。

不同于傳統的非甾體抗炎藥，T-614對禁食老鼠沒有表現出消化道潰瘍類的不良反應〔12〕，在2期臨床試驗過程中，患者的常見不良反應的發生率明顯低于對照組尼美舒利，這也證實T-614有更好的耐受性和安全性〔13〕。膠原誘導關節炎大鼠模型的炎癥呈持續性發展，并且沒有自限傾向，這些特征甚至包括某些臨床表現都非常接近于人類RA〔14〕，因此本實驗也采用了這種動物模型。

4參考文獻

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〔2014-11-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

〔中圖分類號〕R6

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1061-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.017

通訊作者：成沛玉(1967-)，女，碩士，主任護師，碩士生導師，主要從事護理管理、教學及相關科研工作。

1湘潭市第一人民醫院

第一作者：鄒惠美(1989-)，女，在讀碩士，主要從事護理管理、教學及相關科研工作。