非小細胞肺癌組織中ERCC1、RRM1和β-tubulinⅢ的表達及意義

羅　靜　徐美青　郭明發　魏大中　柳常青　孫翔翔

(浙江醫院胸外科，浙江　杭州　310013)

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非小細胞肺癌組織中ERCC1、RRM1和β-tubulinⅢ的表達及意義

羅靜徐美青郭明發魏大中柳常青孫翔翔

(浙江醫院胸外科，浙江杭州310013)

〔摘要〕目的檢測非小細胞肺癌(NSCLC)患者腫瘤組織中核切除修復交叉互補基因(ERCC)1、糖核苷酸還原酶(RR)M1、β-微管蛋白(β-tubulin)Ⅲ表達水平及其臨床意義。方法采用免疫組化法(SP二步法)對80例NSCLC患者腫瘤組織進行ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ檢測，分析患者的ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ表達與臨床特征及預后的關系。結果80例NSCLC腫瘤組織中ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ，蛋白表達陽性率分別為55.0%、42.5%和52.5%。ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ蛋白表達陽性率與患者的性別、年齡、組織學類型、臨床分期、淋巴結轉移均無明顯相關性(P>0.05)；ERCC1、RRM1表達陰性的患者中位生存期及2年生存率分別均高于ERCC1,RRM1表達陽性的患者(P<0.05)；β-tubulinⅢ表達與否對NSCLC患者中位生存期及2年生存率無明顯影響(P>0.05)，結論免疫組化方法檢測ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ的蛋白表達情況有助于篩選NSCLC患者輔助化療藥物，并且對判斷預后具有重要的指導意義。

〔關鍵詞〕ERCC1；RRM1；β-tubulinⅢ；非小細胞肺癌

肺癌是目前我國發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，約80%診斷為非小細胞肺癌(NSCLC)，手術是Ⅰ~Ⅱ期及部分ⅢA期NSCLC患者主要的治療方法之一，雖術后予以輔助化療，但生存率改善不佳，有研究表明5年生存率較前僅改善5%左右〔1,2〕。隨著基因分子診斷技術的發展，依據檢測結果為肺癌患者選擇合適的化療方案，來提高療效，延長生存期，現已發現核切除修復交叉互補基因1(ERCC1)、糖核苷酸還原酶M1(RRM1)、β微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)等表達水平與化療藥物療效及預后密切相關，本研究采用免疫組化方法檢測ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ在NSCLC腫瘤組織中的表達，探討三者與NSCLC臨床和病理特征的關系以及對患者預后的影響。

1資料與方法

1.1臨床資料收集2010年5月至2011年1月安徽省立醫院胸外科手術治療且術后行輔助化療的Ⅰ~Ⅲ期NSCLC患者80例，男49例，女31例，年齡40～72歲；病理類型：鱗癌41例，腺癌39例；臨床Ⅰ期為36例，Ⅱ期為29例，Ⅲ期為15例；淋巴結未轉移29例，有轉移51例。其中8例Ⅰ期患者未化療，其余72例患者均化療，化療方法：采用GP方案者24例(GP方案：吉西他濱1 g/m2第1,8天+順鉑75 mg/m2)，采用TP方案者32例(TP方案：多西他賽100 mg/m2+順鉑75 mg/m2)，采用NP方案者16例(NP方案：長春瑞濱25 mg/m2第1，5天+順鉑75 mg/m2)，連續4~6周期?；颊咦允中g后開始隨訪，在進行隨訪，末次隨訪時間為2013年5月30日。

1.2實驗步驟一抗：ERCC1抗體(稀釋比例1∶100)和β-tubulin Ⅲ抗體(稀釋比例1∶100)購自北京中杉公司。RRM1抗體(稀釋比例1∶100)購自福建邁新公司。二抗和S-P免疫組化試劑盒購自福州邁新公司。取上述80例患者手術標本，經石蠟包埋，切片厚4 μm；常規經二甲苯，無水酒精脫蠟，水化組織切片， 磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次×3 min ；在30%H2O2細胞通透、封閉內源性過氧化物酶(約30 min) ，暴露抗原決定族,封閉非特異；一抗孵育，放入濕盒中37℃1 h或4°過夜，二抗孵育(約30 min)，PBS 洗5次×5 min；SP反應，在37℃ 30 min，DAB顯色系統顯色，加滴蘇木素染液復染后脫水、封片 。

1.3判定標準采取組織化學評分法，采用10個高倍視野，計數腫瘤細胞的陽性比例腫瘤細胞表達數1%~9%，計分0.1；10%~49%計分0.5；>50%計分1，并根據陽性細胞染色強度(0、1、2、3分)，二者分數相乘為該標本的最終得分，根據得分情況，劃定高表達及低表達。

1.4預后評價生存期為治療開始至死亡或隨訪結束的時間；計算中位生存期及2年生存率。

1.5統計學方法采用SPSS13．0軟件進行χ2檢驗，以Kaplan-Meier法進行生存分析，采用Log-rank比較生存率。

2結果

2.1ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ在NSCLC中的表達ERCC1陽性細胞染色為細胞核染色呈黃色，RRM1及β-tubulinⅢ陽性細胞染色為細胞質染色呈黃色，見圖1。

圖1　NSCLC中ERCC1、 RRM1、β-tubulinⅢ 的免疫組化表達(DAB，×40)

2.2ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ表達與NSCLC臨床病理特征的關系80例NSCLC患者中ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ陽性表達率分別為55%(44/80)、 42.5%(34/80)、52.5%(42/80)。ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ表達與年齡、性別、期別、病理類型，淋巴結轉移均無明顯相關性(P>0.05),見表1。

表1　ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ與

2.3ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ表達在NSCLC組織中表達的相關性ERCC1和RRM1的表達呈正相關(P=0.040)，RRM1和β-tubulinⅢ的表達呈正相關(P=0.019)，ERCC1和β-tubulinⅢ的表達呈正相關(P=0.027)。

2.4ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ表達與生存期之間的關系44例ERCC1陽性患者中，中位總生存期18.6個月，2年生存率為49.6%，36例ERCC1陰性的患者中，中位總生存期22.4個月，2年生存率為58.7%，ERCC1陰性患者中位總生存期明顯長于ERCC1陽性患者(P=0.043)，Ⅰ期ERCC1陽性和陰性患者的中位生存期分別是33.4個月33.1個月，Ⅱ期和Ⅲ期ERCC1陰性中接受鉑類化療的患者的中位生存期明顯高于陽性患者，Ⅱ期ERCC1陰性患者和陽性患者的中位生存期分別是26.4個月和23.5個月,Ⅲ期ERCC1陰性患者和陽性患者的中位生存期分別是19.4個月和16.3個月。34例RRM1陽性患者中，中位總生存期18.9個月，2年生存率為42.5%，46例RRM1陰性患者中,中位總生存期21.6個月，2年生存率為59.4%，RRM1陰性患者中位總生存期明顯長于RRM1陽性者(P=0.034)，Ⅰ~Ⅲ期RRM1陰性患者的中位生存期明顯高于陽性患者，Ⅰ期RRM1陰性患者和陽性患者的中位生存期分別是個34.1個月和31.6個月，Ⅱ期RRM1陰性患者和陽性患者的中位生存期分別是25.2個月和22.5個月,Ⅲ期RRM1陰性患者和陽性患者的中位生存期分別是個18.2月和16.0個月。42例β-tubulinⅢ陽性患者中,中位總生存期18.1個月，2年生存率為44.1%，38例β-tubulinⅢ陰性患者中,中位生存期19.4個月，2年生存率為49.7%，β-tubulinⅢ陰性患者中位總生存期與β-tubulinⅢ陽性者無差別(P=0.94)，Ⅰ~Ⅲ期β-tubulinⅢ陰性和陽性患者的中位生存期分別是：33.5個月，26.0個月，17.3個月和32.9個月，27.1個月，16.8個月。

3討論

目前肺癌術后治療以化療為主，因個體之間的差異性，不同病理類型和分期的肺癌患者，對標準化療敏感性差異較大，因此近年來提出了針對不同患者進行個體化治療的概念通過檢測ERCC1、RRM1 、β-tubulinⅢ基因表達，表皮生長因子受體(EGFR)等基因體細胞突變等分子標記物，來進行制定個體化治療方案，提高化療效率，并具有預測預后的作用。本研究發現，ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ蛋白表達陽性率與患者的臨床特征均無明顯相關性，并顯示ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ蛋白表達兩兩之間呈正相關，可作為指導臨床的標志物。

ERCC1是DNA損傷修復途徑中最主要的基因之一，則具有損傷識別和切除5’端的雙重作用，在核苷酸切除修復中起到限速或調節的重要作用，是DNA修復的一個重要途徑。鉑類藥物抗腫瘤作用的主要靶點為DNA，其細胞毒性主要在于與細胞內親核DNA結合，形成鉑-DNA加合物，影響DNA復制轉錄，導致其致命損傷。ERCC1作為核苷酸切除修復的限速酶參與DNA的修復并且有可能作為使用鉑類化療藥的預測的標記物〔3〕，Simon等〔4〕根據ERCC1基因表達水平進行研究，結果證明ERCC1低表達者用鉑類治療，ERCC1高表達者用非鉑治療，可以提高肺癌治療的有效率。ERCC1基因表達及多態性與NSCLC的發病、臨床特點、生物學行為、預后等存在一定的相關性〔5〕。本研究發現ERCC1基因蛋白表達陰性其中位生存期及2年生存率明顯好于陽性患者(P=0.043)，與Vilmar等〔6〕研究結果相似。Olaussen等〔7〕報道提示對于早期肺癌患者ERCC1表達陽性具有保護作用，對于ERCCI陰性的患者隨機接受輔助化療明顯延長生存時間，本研究Ⅰ~Ⅲ期ERCC1陰性患者接受化療ERCC1低表達患者生存期長于ERCC1高表達者與其相符。對于正常人群，DNA修復基因可以降低肺癌的發病風險，而對于肺癌患者，DNA修復基因可以導致化療藥物的耐藥，使化療療效降低。

RRM1是RNA合成的前體，它能使核糖核苷酸還原成為脫氧核糖核苷酸，是DNA 合成通路中的限速酶，是鹽酸吉西他濱(GEM)耐藥的一個重要預測指標 。吉西他濱是嘧啶類抗代謝藥物，在細胞內經過核苷激酶的作用轉化成具有活性的二磷酸核苷(dFdCDP)及三磷酸核苷(dFdCTP)，通過抑制DNA合成而發揮細胞毒作用，吉西他濱干擾了核苷酸還原酶的功能，因此推測RRM1的表達可能與吉西他濱耐藥有關。Zheng等〔8〕研究RRM1在體內外的表達，發現RRM1在腫瘤組織當中高表達對鉑類+吉西他濱化療治療中具有重要的預測指標。Rosell等〔9〕檢測了100例GEM 方案治療的晚期NSCLC患者標本的RRM1 mRNA發現RRM1 mRNA低表達者明顯受益，中位生存期高于高表達者。國外研究〔10〕發現早期非小細胞肺癌術后RRM1患者高表達提示預后較好，而晚期接受GP方案化療的患者RRM1高表達提示預后較差，國內外文獻顯示RRM1的基因表達與吉西他濱耐藥相關，肺癌患者RRM1高表達的患者比低表達的患者較難從吉西他濱與鉑類聯合化療中獲益。本研究也證實早期RRM1陽性表達組的中位生存期長于RRM1陰性，而晚期接受化療的RRM1陰性表達組的中位生存期明顯長于陽性表達組,RRM1的表達情況同肺癌腫瘤細胞的生物學行為、腫瘤的進展及預后存在相關關系。

β-tubulinⅢ蛋白是一類微管蛋白，是構成細胞骨架的主要成分，在細胞有絲分裂當中起重要作用，研究表明其表達對紫杉類耐藥有關。國外對NSCLC術后病理進行免疫組化檢查，結果顯示β-tubulinⅢ表達對紫杉醇具有相關性，可作為重要生物標記物預測多西他賽的敏感性，Seve等〔11〕臨床研究分析顯示β-tubulinⅢ高表達者預后差，但較低表達者似乎更能從鉑類+紫杉醇的輔助化療中獲益，另一研究表明分組給予紫杉類加鉑類，或者吉西他濱加鉑類方案，結果顯示β-tubulinⅢ低表達組對紫杉加鉑類的受益程度明顯高于高表達組及吉西他濱組。Reiman等〔12〕研究β-tubulinⅢ陽性者在早期非小細胞肺癌具有預測性作用，β-tubulinⅢ高表達時可從長春瑞濱加順鉑的輔助化療中獲益；而低表達時可從紫杉加鉑類的化療中獲益。Dumontet等〔13〕在β-tubulinⅢ表達與預后關系的研究中發現，β-tubulinⅢ高水平表達患者的無疾病生存期明顯低于低表達者，Vilmar等〔14〕也報道，β-tubulinⅢ低水平表達患者有著更長的無疾病生存期，及更高的總生存率，是重要的預測指標。本研究結果顯示，β-tubulinⅢ性高表達與低表達比較時，患者中位生存期和2年生存率較為陰性者未見明顯降低，Ⅰ~Ⅲ期β-tubulinⅢ陰性和陽性患者的中位生存期未見明顯差異(P>0.05)，雖與上述研究存在一定差異，但本研究不能評價對多西他賽敏感性的關系。

肺癌的發生與發展過程當中包含了多種基因的表達，并且一些基因與腫瘤耐藥有關，本研究回顧性分析ERCC1、RRM1和β-tubulinⅢ三者關系，發現三者呈明顯的正相關性，這可能與肺癌的發生，發展有著密切的關系，此外研究證實ERCC1、RRM1和β-tubulinⅢ等分子標志物的表達狀態可能僅對化療的療效及預后有一定預測價值，而ERCC1，RRM1的低表達具有更長的生存期。因此對ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ基因蛋白的檢測，具有臨床價值，值得進一步研究。

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〔2014-05-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

〔中圖分類號〕R734.2

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1113-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.042

通訊作者：徐美青(1962-)，男，教授，碩士生導師，主要從事胸外科疾病研究。

基金項目：衛生部分子診斷技術在肺癌個體化治療中的應用研究課題資助項目(No.W2012F115)

第一作者：羅靜(1985-)，男，碩士，主要從事胸外科疾病研究。