三葉因子3與生長分化因子-15在甲狀腺濾泡性腫瘤中的表達及意義

徐　璇　于世鵬　劉　杰

(山東大學，山東　濟南　250100)

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三葉因子3與生長分化因子-15在甲狀腺濾泡性腫瘤中的表達及意義

徐璇于世鵬1劉杰

(山東大學，山東濟南250100)

〔摘要〕目的探討三葉因子3(TFF3)及生長分化因子-15(GDF-15)在甲狀腺濾泡性腫瘤中的表達及意義。方法應用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法分別檢測甲狀腺濾泡狀癌(FTC)、甲狀腺濾泡性腺瘤(FA)及正常甲狀腺(NT)組織中(各30例)TFF3 mRNA及GDF-15 mRNA的表達。結果正常甲狀腺組織中TFF3 mRNA的表達量明顯高于甲狀腺濾泡狀癌及FA(P<0.01)，而FA中的TFF3 mRNA的表達量明顯高于甲狀腺濾泡狀癌(P<0.05)。甲狀腺濾泡狀癌及FA中GDF-15 mRNA的表達量明顯高于正常甲狀腺組織(P<0.01)，而甲狀腺濾泡狀癌中的GDF-15 mRNA的表達量明顯高于FA(P<0.01)。結論TFF3 mRNA的低表達和GDF-15 mRNA高表達可能與甲狀腺濾泡性腫瘤發生發展相關，對進一步區分甲狀腺濾泡性腫瘤良惡性，提高診斷準確率有重要意義。

〔關鍵詞〕甲狀腺濾泡狀癌；甲狀腺濾泡性腺瘤；三葉因子3；生長分化因子-15；RT-PCR

甲狀腺癌是常見的內分泌系統惡性腫瘤，其發病率呈逐年上升趨勢〔1〕，因而甲狀腺惡性腫瘤的確切發病機制及如何快速、有效地鑒別甲狀腺良惡性腫瘤已成為目前研究的熱點。目前甲狀腺細針抽吸活檢細胞學檢查(FNAB)被認為是術前評估甲狀腺腫瘤良惡性的最好診斷工具，但是對于臨床甲狀腺病理中最難鑒別的濾泡性腫瘤，細胞學檢查并不能明確診斷，因而發掘靈敏度高、特異性強的腫瘤標志物成為諸多學者努力的方向。三葉因子(TFF)3為近年來研究較多的一種小分子多肽，其通過影響細胞信號轉導、調節細胞凋亡等過程促進或抑制腫瘤的發生、發展。生長分化因子(GDF)-15是轉化生長因子-β(TGF-β)超家族中的一員，參與組織胚胎發育、細胞應激響應調控、炎癥反應及急性損傷修復等生理病理過程，并對腫瘤的發生、發展起促進或抑制作用。本研究采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法分別檢測甲狀腺濾泡狀癌、甲狀腺濾泡性腺瘤(FA)及正常甲狀腺組織(甲狀腺濾泡性腺瘤周邊正常甲狀腺組織)中TFF3 mRNA及GDF-15 mRNA的表達，探討其與甲狀腺濾泡性腫瘤發生發展的關系及對甲狀腺濾泡性腫瘤良惡性的鑒別意義。

1材料與方法

1.1標本來源從2011年9月1日至2013年7月6日在濟寧醫學院附屬醫院乳甲外科行手術治療的甲狀腺濾泡狀癌、FA患者中隨機選取各30例。所有研究對象均經過濟寧醫學院附屬醫院倫理委員會審查批準，并與患者及家屬簽署書面知情同意書。所有患者術前均未接受放化療、內分泌治療及其他免疫治療；RT-PCR標本均于手術切除后0.5 h內采集，迅速置于液氮中保存，0.5 h內轉至-80℃冰箱中保存備用，所有標本病理類型在術后均經有經驗的病理科專家證實。

1.2方法RT-PCR法測定甲狀腺濾泡性腫瘤及正常甲狀腺組織中TFF3 mRNA及GDF-15 mRNA的表達。首先應用TRIzol試劑盒(Invitrogen)提取100 mg甲狀腺組織中的總RNA。紫外分光光度儀測定RNA濃度和純度，波長280 nm與260 nm讀取的吸光度比值在1.8~2.0，表明提取的RNA無明顯降解，質量較好，用作RT-PCR模板。然后取5 μg總RNA，逆轉錄，收集cDNA，用PCR法擴增目的片段，引物由上海生物工程公司設計合成。引物序列TFF3正義鏈：GACAGTTCTTCGTGCCTGAGA，反義鏈：GAGTCTTTTCCTGCCCTTGAG；GDF-15正義鏈：AAGAACTCAGGACGGTGAATG，反義鏈：CCGCAACTCTCGGAATCTG。RT-PCR反應體系：在PCR專用管中依次加入cDNA 2 μl、正義鏈引物2 μl、反義鏈引物2 μl、Supermix 44 μl，共計50 μl，離心半徑8.25 cm、1 200 r/min，離心35 min混勻。反應條件：預變性94℃ 2 min進入循環，變性94℃ 30 s，退火TFF3 57℃/GDF-15 55℃ 30 s，復性72℃ 30 s，TFF3 35/GDF-15 32個循環，(β-actin 25個循環，最后72℃ 5 min延伸)，取PCR產物(12.5+2.5)μl DNA上樣緩沖液在3%瓊脂糖凝膠上電泳，拍照后分析。

1.3統計學方法結果以中位數和四分位數間距表示，采用SPSS13.0軟件對兩組間比較用兩獨立樣本非參數檢驗(U-Mann-Whitney檢驗)，多組間比較行多個獨立樣本非參數檢驗。

2結果

見表1、圖1。甲狀腺濾泡狀癌、FA及正常組織中均可檢測到TFF3 mRNA及GDF-15 mRNA的表達。正常甲狀腺組織中TFF3 mRNA的表達量高于甲狀腺濾泡狀癌(Z=-4.668，P=0.000)和FA(Z=-3.320，P=0.001)，而FA中TFF3 mRNA的表達量高于甲狀腺濾泡狀癌(Z=-2.522，P=0.0125)。甲狀腺濾泡狀癌(Z=-4.062，P=0.000)和FA(Z=-2.915，P=0.004)中GDF-15 mRNA的表達量高于正常甲狀腺組織，而甲狀腺濾泡狀癌中GDF-15 mRNA的表達量高于FA(Z=-2.916，P=0.004)。

表1　不同甲狀腺組織中TFF3 mRNA及

與正常甲狀腺組織比較:1)P<0.01；與FA組織比較:2)P<0.05，3)P<0.01

1~3：正常甲狀腺組織；甲狀腺濾泡狀癌組織；FA組織圖1　RT-PCR分析TFF3、GDF-15在不同甲狀腺組織中的表達

3討論

我國人群中甲狀腺結節的檢出率約為20%~76%，其中又有5%~15%為惡性〔1〕。臨床上可通過病史詢問、觸診、影像學檢查、細針抽吸活檢等方法來評估其良惡性。但是對于甲狀腺濾泡性腫瘤，術前診斷率不高，通常術后性組織病理學才能確診。近年來現代分子生物技術的迅猛發展，為我們研究其發病機制提供了技術支持，同時也為找到可靠腫瘤標記物打下堅實基礎。因而，通過分子生物技術研究甲狀腺濾泡性腫瘤的發病機制及找出靈敏度和特異性兼備的腫瘤標記物成為許多學者奮斗的目標。

人的TFF3基因定位于21q22.3區域，TFF3分子由59個氨基酸組成，含有一個P結構域，其羧基端含有第7個半胱氨酸殘基，有利于形成同源二聚體與其他蛋白分子相互作用〔2，3〕。TFF3主要在小腸和結腸的杯狀細胞，胃竇黏膜中高表達〔4〕，對黏膜的再生和修復起非常重要的作用，此外它還參與信號轉導、調節細胞凋亡、抑制或促進腫瘤發生等過程。目前認為TFF3抑制腫瘤細胞生長的作用機制主要有以下途徑：① 降低MAPK/ERK的磷酸化，減少細胞外刺激信號轉導致細胞及其核內，從而抑制細胞的增殖、分化及凋亡等生物學反應〔5〕；② 增加細胞周期激酶抑制劑p16INK4和p21CIP1/Waf1水平，兩者分別與不同的細胞周期素結合，阻止細胞由G1期進入S期，從而抑制細胞增殖；③ 抑制 cyclinD1/cdk4 和cyclinE/cdk2 復合物的活性，從而阻止細胞周期中S期的啟動，使細胞靜止在G1期，進一步抑制細胞增殖〔6〕等。生長分化因子-15是1997年Bootcov等〔7〕從激活的巨噬細胞中發現的TGF-β 超家族的成員，基因定位于19p13.1-13.2，由兩個外顯子和一個內含子構成。生理情況下，GDF-15只在胎盤及前列腺等少數組織大量表達，當機體荷瘤時，可檢測出GDF-15表達增加。多項研究表明，GDF-15在前列腺癌、胃癌、結直腸癌、乳腺癌、肺癌、顱內腦瘤、黑色素瘤、胰腺癌等腫瘤的細胞、血清或腦脊液中表達升高〔8〕。GDF-15可通過以下方面促進促進腫瘤的發生發展：①激活胞內TGF-βⅠ型和Ⅱ型受體及Smad信號轉導蛋白復合體，使其作為轉錄因子與DNA的信號識別序列CAGAC結合，從而調控細胞增殖〔9〕；②激活細胞內信號分子，如Ras/MAPKs、PI3K/Akt/mTOR信號途徑〔10〕，Ras激活后，導致GTPase活性下降，使Ras保持持續活化狀態，從而激活下游MAPK級聯反應，導致細胞大量增殖而發生惡性轉化〔11〕，GDF-15可能為PI3K/Akt/mTOR通路的一個上游靶基因，其能通過激活PI3K/Akt/mTOR信號途徑通路阻止細胞凋亡〔12〕；③抑制樹突細胞的成熟，使T細胞增殖活化為效應T細胞過程中的協同刺激分子水平降低，抑制了T細胞的活化，使細胞毒性T細胞介導的抗腫瘤效應減弱，進而促進腫瘤的免疫逃逸〔13〕。

本研究提示TFF3 mRNA在甲狀腺濾泡性腫瘤中的表達有一定的特異性，其可能參與了甲狀腺濾泡性腫瘤的發生發展過程。其在良惡性不同的甲狀腺濾泡性腫瘤中表達不同，提示TFF3 mRNA對甲狀腺濾泡性腫瘤的良惡性的鑒別具有重要參考價值。其在甲狀腺濾泡狀癌組織中呈低表達狀態，提示TFF3可能在甲狀腺濾泡性腫瘤的發生發展過程中起到保護機體的作用。這與Krause等〔14〕、Karger等〔15〕、Takano等〔16〕和Patel等〔17〕的觀點一致。GDF-15 mRNA在正常甲狀腺、FA、甲狀腺濾泡狀癌組織中均有表達，并且其表達量依次升高，提示GDF-15 mRNA同樣也參與了甲狀腺濾泡性腫瘤的發生發展過程。其在良惡性不同的甲狀腺濾泡性腫瘤中表達也不同，提示GDF-15亦對甲狀腺濾泡性腫瘤的良惡性的鑒別具有重要參考價值。然而GDF-15 mRNA在甲狀腺濾泡狀癌組織中呈高表達狀態，提示GDF-15可能對甲狀腺濾泡性腫瘤的發生發展起促進作用，并且可能為甲狀腺濾泡狀癌病情進展、惡性轉移的重要信號。這與Krause等〔14〕和Weber等〔12〕觀點一致。并且Krause等〔14〕研究證實聯合檢測以上兩種分子在甲狀腺濾泡性腫瘤中的表達可能對其良惡性的鑒別更具參考價值。但是，TFF3與GDF-15具體通過何種途徑影響甲狀腺濾泡狀癌發生發展，仍需大樣本量的臨床資料統計分析及更深層次的實驗室研究。

綜上所述，本研究認為，TFF3和GDF-15參與了甲狀腺濾泡性腫瘤的發生發展，TFF3可能在此過程中起抑制腫瘤發生發展的作用，而GDF-15可能對其發生發展起促進作用，其核酸水平的檢測可為鑒別甲狀腺濾泡性腫瘤的良惡性提供參考依據，這與國外使用不同方法(cDNA arrays，SAGE，adapter-tagged competitive PCR)所得到的研究結果一致〔12，16，18，19〕。因此，推測應用檢測TFF3 mRNA和GDF-15 mRNA表達來輔助識別甲狀腺濾泡性腫瘤的良惡性，對甲狀腺濾泡性腫瘤的術前診斷具有重要參考價值。

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〔2014-09-15修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

〔中圖分類號〕R581.9

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)05-1130-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.050

通訊作者：于世鵬(1963-)，男，教授，主任醫師，碩士生導師，主要從事甲狀腺疾病研究。

1濟寧醫學院附屬醫院內分泌科

第一作者：徐璇(1988-)，女，碩士，主要從事內分泌與代謝病的研究。