醬香型白酒酒糟中耐酸產酯香細菌的篩選

陳　劍，蔣英麗，程　偉，高　鴻，羅愛民(.四川大學輕紡與食品學院食品工程系，四川成都60000；.四川郎酒集團有限責任公司，四川古藺646500)

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醬香型白酒酒糟中耐酸產酯香細菌的篩選

陳劍1，蔣英麗2，程偉2，高鴻1，羅愛民1
(1.四川大學輕紡與食品學院食品工程系，四川成都610000；2.四川郎酒集團有限責任公司，四川古藺646500)

摘要：選取郎酒廠堆積后的酒糟，從中分離純種細菌。再以麩皮為培養基進行純種發酵，通過改變麩皮的酸度及培養溫度，以感官評定和酯化力為標準，從中篩選出耐酸耐高溫且產酯香好的細菌ZP-3和ZP-28。以期通過添加該細菌強化曲到酒糟中，對改善酒糟的堆積時間和堆積效果有重要意義。

關鍵詞：酒糟；麩曲；細菌；酯香味；白酒

醬香型白酒屬大曲酒，主要以高粱為原料，酒質具有醬香突出、幽雅細膩、柔和綿長、酒體醇厚、入杯香氣持久、空杯留香久等風格特點[1]，其最顯著特點就是空杯留香。但其生產工藝周期長、糧耗多、產量低、資金周轉慢、成本高。為了減少環境對產品品質的影響，縮短發酵周期及降低成本，因此采用純種微生物制麩曲成為科研工作的努力方向[2]。

蒸酒后的酒糟在入池發酵前都要經過一個堆積的過程，微生物大量生長繁殖。酒糟的堆積是生成醬香型白酒的香味成分或香味前體的過程[3]，對酒質的影響很大。與其他類型的白酒相比較，醬香型白酒的釀造周期較長，為8次發酵、7次取酒，以高粱為原料，經數次加曲、堆積、發酵、蒸酒，隨著輪次的增加，酒糟的酸度也是隨著增加的，所以篩選耐酸性細菌投入生產有利于微生物的生長發酵。

目前釀酒相關行業的科研人員對產酯的研究集中在霉菌[4-6]和酵母菌[7-8]，如黃丹等[4]從濃香型大曲中篩選出1株高產酯的黃曲霉，胡沂淮等[5]從洋河大曲中篩選出1株高酯化力紫紅曲霉菌株，原輕工業部發酵工業研究所分離的1312、1342、1343高產酯酵母菌，牛廣杰[8]從中高溫大曲中篩選出的BQC-1Y高產酯酵母等。關于大曲中產香細菌有一些基礎工作研究，如劉陽等[9]從中高溫大曲中篩選出高產酯10#細菌，然而有關酒糟中微生物的研究較少，實際應用的優良產香耐酸耐溫菌株也很少。本課題通過篩選出產香耐酸耐高溫的菌株，以酯化力為評定標準來篩選。利用純種培養技術，經擴大培養，再重新加入酒糟中使用，以期可用于改變酒糟中的菌落結構，從而可改善酒糟堆積時間或堆積效果，有利于改善酒質，生產優質酒。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

樣品：郎酒廠的堆積成熟酒糟。

試劑：本試驗中應用的生化試劑均為分析純及以上級別，溶液由蒸餾水配制。

儀器設備：JA1203分析天平，立式壓力蒸汽滅菌鍋，超凈工作臺，電熱干燥培養箱，真空干燥器，恒溫振蕩器，電熱鼓風干燥箱，高速粉碎機，HH-4數顯恒溫水浴鍋，蒸餾裝置，pHs-3c酸度計，78HW-1恒溫磁力攪拌器等。

培養基：牛肉膏蛋白胨培養基，LB培養基，麩皮培養基。

1.2分析方法

水分測定：采用常壓烘干法。

酸度、氨基態氮測定：采用電位滴定法[10-12]。

酯化力測定：參照QB/T 4257—2011。

1.3試驗方法

1.3.1菌種的分離純化

細菌的分離純化用牛肉膏蛋白胨培養基。先將酒糟制備成菌懸液，隨后進行濃度梯度稀釋，吸取0.1 mL的菌懸液涂布于平板上，于37℃下倒置培養1 d。通過平板劃線法將長勢良好的細菌進行分離純化，將純化后的菌種移入斜面保藏，備用。

1.3.2產酯香菌株篩選試驗

在超凈工作臺中操作，從斜面上挑取1環菌種接入LB液體培養基，進行菌種的活化富集，于37℃下振蕩培養15 h，培養結束后，按照3％接種量接種到三角瓶麩曲，在36～37℃下培養72 h，培養期間，每天至少搖動2次三角瓶，使麩曲松散，有利于菌種的生長繁殖和發酵。培養結束后，先進行感官評定[13]，隨后于40℃干燥箱中通風干燥，粉碎保存備用，用于理化指標的測定。

麩皮培養基以麩皮為主，加入20％稻殼。稻殼先經過蒸煮去除雜味，攤晾冷卻干燥后與麩皮進行加水拌和，加水量70％。麩皮和稻殼拌和均勻后進行常壓蒸料1 h，隨后進行三角瓶的分裝，0.1 MPa壓力滅菌30 min。

1.3.3耐高溫產香菌株篩選試驗

麩皮培養基的制作方法同1.3.2，只改變三角瓶麩曲的培養條件，將培養溫度提高。在醬香型白酒生產中，高溫堆積階段溫度可達到50℃左右[14-16]，所以本試驗選擇在49～50℃下培養72 h。培養結束后，放入干燥箱于40℃通風干燥，經粉碎保存備用，用于理化指標的測定，從中篩選出耐高溫的細菌。

1.3.4耐酸耐高溫產香菌株篩選試驗

麩曲的培養方法同1.3.3，但改變麩皮培養基的酸度，用乳酸[17-18]調節培養基酸度為0.4 mmolH/10 g干重、0.5 mmolH/10 g干重、0.6 mmolH/10 g干重。在49～50℃下培養72 h，40℃烘干備用，測其理化性質，從中篩選耐酸耐高溫的細菌。

2　結果與分析

2.1菌種的分離篩選結果

利用平板稀釋涂布法和平板劃線法，經反復分離純化，得到22株菌株，多數呈現白色菌落，部分為黃色菌落和紅色菌落，單菌落于4℃斜面保存。經顯微鑒定，這22株菌株為革蘭氏陽性菌，其中多數為桿菌，少部分為球菌。

圖1　ZP-3(左)和ZP-27(右)鏡檢圖片

2.2產酯香菌株的篩選結果

對篩選出來的22株菌株進行麩曲培養，每株菌株做3個平行樣，其中ZP-13菌株生長發酵不良，糧糟味濃，故舍棄。根據感官評定的結果，篩選出產酯香味的菌株，測定其麩曲的酯化力，每項理化指標做3個重復的測定，測定結果見表1。

表1　常溫麩曲的感官和理化指標

酯化力測定結果表明，在常溫培養下，ZP-8、ZP-2、ZP-17等菌株接種的麩曲酯化力較高，表明這些菌株產酯能力較強，對麩曲的呈香呈味有一定的影響。在感官評價中ZP-2、ZP-17、ZP-36等菌株的產酯香較好，ZP-8、ZP-11、ZP-47等菌株的產氨味濃。氨味的存在雖對香味的評定有一定的影響，但酯化力的測定結果與感官評價結果基本一致，可以從感官評價結果選出產酯香的強弱來判斷酯化力的變化。進而從這些菌株中篩選出耐高溫耐酸的產香菌株。

2.3耐高溫菌株的篩選結果

醬香型白酒的堆積為高溫堆積，溫度約為50℃[14]，篩選在此溫度下生長良好的菌株。根據36～37℃麩曲培養結果，選擇表1中的菌株，調整麩曲的培養溫度為49～50℃。根據感官評定的結果，結合麩曲的成團現象，可判定出菌株生長狀況。如麩曲培養結果松散，糧糟味較濃，表明菌種生長較差，發酵不良，即在該溫度下不適宜其生長。篩選生長良好的菌株，進行酯化力的測定，測定結果見表2。

表2　麩曲的感官和理化指標

由表2可知，ZP-11、ZP-34、ZP-5等菌株酯化力較強，產酯香較好，ZP-17、ZP-18、ZP-35等菌株的酯化力較低，在感官評定時其產酯香較差。與常溫麩曲測定結果對比，多數菌株酯化力有所下降，表明在此條件下產酶較弱或酶活力不高。酯化酶受溫度影響較大，有研究表明與真菌相比較，一般細菌的酯化酶作用溫度較高[19]，溫度對于菌株產酶能力的影響不同[20]，不同菌株對于溫度的敏感性不同。

2.4耐酸耐高溫菌株的篩選結果

根據上一步測定結果及麩曲發酵生長情況，從中篩選出10株耐高溫菌株，分別為ZP-2、ZP-3、ZP-5、ZP-7、ZP-11、ZP-22、ZP-27、ZP-28、ZP-34、ZP-47，進行下一步耐酸性試驗。先進行預試驗，調節麩曲酸度分別0.3mmolH/10g干重、0.5mmolH/10g干重、0.7mmolH/10g干重、0.9 mmolH/10 g干重、1.1 mmolH/10 g干重、1.3 mmolH/10 g干重、1.5 mmolH/10 g干重、1.7 mmolH/10 g干重、1.9 mmolH/10 g干重、2.1 mmolH/10 g干重，選擇2株菌株ZP-2和Y5進行接種培養，在49～50℃下培養72 h。酸度為0.7～2.1 mmolH/10 g干重時，麩曲松散，糧糟味很濃，表明在酸度大于0.7 mmolH/10 g干重的情況下，菌株生長不良。因此將篩選出的10株耐高溫細菌分別接種到0.4 mmolH/10 g干重、0.5 mmolH/10 g干重、0.6 mmolH/10 g干重3個酸度麩皮培養基中，用于測定不同菌種的耐酸性，最終篩選出耐酸且產香好的細菌。

2.4.1麩皮酸度為0.4 mmolH/10 g干重的測定結果

用乳酸調節麩皮培養基的酸度為0.4 mmolH/10 g干重，經分裝滅菌后接種，以49～50℃培養，其中ZP-7的麩曲松散，糧糟味較濃，為發酵不完全，表明該菌株不適宜在該條件下生長，為不耐酸菌株。其他9株菌株發酵良好，表明可耐酸，篩選出進行酯化力的測定，測定結果見表3。

表3　麩曲的感官和理化指標

由表3可知，在該培養條件下，ZP-3、ZP-34、ZP-22、ZP-2等菌種，麩曲的酯化力較高，其產酯香較好。ZP-5、ZP-27等酯化力較差，感官評定結果表明，產酯香較差。與未添加乳酸的麩曲培養結果相比，不同菌株酯化力變化不同，如ZP-3、ZP-22、ZP-34等菌株酯化力增加，ZP-5、ZP-27等菌株酯化力降低。劉陽[9]的研究結果表明，酯化酶在不同pH值下其活性差別較大，不同來源的酯化酶其最適pH值差別也較大。因此在不同環境下不同菌株的酯化力不同，其變化規律不同。

2.4.2麩皮酸度為0.5 mmolH/10 g干重的測定結果

用乳酸調節麩皮培養基的酸度為0.5 mmolH/10 g干重，經分裝滅菌后接種，以49～50℃培養，其中ZP-5、ZP-7、ZP-22和ZP-47的麩曲松散，糧糟味較濃，為發酵不完全，表明這些菌株不適宜在該條件下生長，為不耐酸菌株。其他菌株生長良好，酯化力測定結果見表4。

表4　麩曲的感官和理化指標

酯化力測定結果表明，ZP-28、ZP-27、ZP-3的酯化力較強。但麩曲培養結果表明，ZP-27菌株生長發酵較慢，在72 h終止發酵時，麩曲顏色較淺，成團性較差。與麩皮酸度是0.4 mmolH/10 g干重的培養結果相比較，其中ZP-28、ZP-27菌株的酯化力增加，ZP-3菌株酯化力下降，ZP-2、ZP-34菌株酯化力下降較多。

2.4.3麩皮酸度為0.6 mmolH/10 g干重的測定結果

當麩皮的酸度調節為0.6 mmolH/10 g干重時，6株菌株的麩曲發酵結果均不良，糧糟味較濃，表明這些菌種無法在該酸度條件下生長。

耐酸性試驗結果表明，從酒糟中篩選出的細菌，最高可在酸度為0.5 mmolH/10 g干重條件下生長，其中ZP-3、ZP-28菌株培養的麩曲感官評定和理化指標測定結果好，可篩選后進行下一步試驗研究，即投入釀酒的生產試驗。

3　結論

酒糟的堆積是生成醬香型白酒的香味前體或香味成分的過程，對酒質的影響很大。醬香型白酒的堆積為高溫堆積，溫度可達到50℃左右[15]，所以從酒糟中分離出耐高溫耐酸產香好的細菌，經純種發酵，擴大培養制作成強化曲，投入醬香型白酒的生產，通過改變菌落結構，可獲得較好的效果，有利于改善酒質，對釀造高質的醬香型白酒具有重要意義。本課題目的在于篩選耐酸耐熱產酯香細菌，目前處于實驗室研究階段，已從酒糟中篩選出ZP-3、ZP-28菌株，其中ZP-28菌株酯化力較強，為28.362 U。關于生產實踐階段，還需要進一步的研究探討。

參考文獻：

[1]徐海榮.中國酒事大典[M].北京：華夏出版社,2002：921-922.

[2]趙希玉,王曉鳳.用麩曲法生產醬香型白酒工藝研究[J].釀酒,2003,30(4)：29-30.

[3]馮雨.醬香型白酒的堆積發酵[J].釀酒科技,2013(2)：80-81.

[4]黃丹,劉清斌,劉達玉,等.一株產己酸乙酯酯化酶霉菌的分離鑒定及產酶條件研究[J].釀酒科技,2008(2)：27-29.

[5]胡沂淮,賈亞偉,戴源,等.酯化紅曲的篩選和酯化酶酶學性質研究[J].釀酒科技,2013(8)：23-27.

[6]王曉丹,李付麗,胥思霞,等.一株產酯化酶菌株的分離鑒定及產酶[J].釀酒,2014 (5)：42-47.

[7]沈怡方.白酒生產技術全書[M].北京：中國輕工業出版社,2007：329-345.

[8]牛廣杰.優良產酯酵母菌的篩選及發酵性能研究[J].釀酒,2013(6)：56-59.

[9]劉陽.中高溫大曲中產酯化酶細菌的選育[D].合肥：安徽工程大學,2013.

[10]陳安靜,周軍,徐德富,等.電位滴定法測定大曲酸度的研究[J].釀酒科技,2011( 8)：112-113.

[11]潘祖亭.分析化學[M].北京：科學出版社,2010.

[12]杜亞飛,蔣英麗,何世興,等.大曲中總酸和氨基態氮的連續滴定[J].中國釀造,2014,33(6)：132-134.

[13]明紅梅,郭志,周健,等.濃香型大曲中產香微生物的篩選及鑒定[J].現代食品科技,2015(4)：186-191.

[14]唐玉明,任道群,姚萬春,等.醬香型酒酒糟堆積過程溫度和微生物區系變化及其規律性[J].釀酒科技,2007(5)：54-58.

[15]莊名揚.再論美拉德反應產物與中國白酒的醬香味[J].釀酒科技,2005(5)：34-39.

[16]劉婧瑋,蔣英麗,沈毅,等.醬香型白酒中風味物質的成因研究現狀[J].釀酒科技,2013(5)：85-89.

[17]羅惠波,李光輝.耐酸酵母菌的篩選研究[J].四川理工學院學報,2004(12)：151-154.

[18]鄧林.窖泥中梭狀菌的耐酸耐酒性能測試[J].釀酒科技,1993(59)：39.

[19]Kademi A,A????t-Abdelkader N,Fakhreddine L,et al.Athermostable esterase activity from newly isolated moderate thermophilic bacterial strains[J].Enzyme and Microbial Technology,1999,24(5)：332-338.

[20]黃丹,張強,嚴芳,等.濃香型大曲中酯化酶細菌的分離鑒定及產酶條件研究[J].中國釀造,2009,28(8)：57-59.

Screening of Acid-tolerant and Ester-aroma-producing Bacteria Strains From Jiangxiang Distiller’s Grains

CHEN Jian1,JIANG Yingli2,CHENG Wei2,GAO Hong1and LUOAimin1
(1.College of Light Industry,Textile and Food Engineering,Sichuan University,Chengdu,Sichuan 610000;2.Sichuan Langjiu Group Co.Ltd.,Gulin,Sichuan 646500,China)

Abstract:In this study,pure-species bacteria was isolated from distiller’s grains after the stacking in Langjiu Distillery.Then pure-species fermentation was done with bran as the culture mediums,and heat-tolerant,acid-tolerant and ester-aroma-producing strains (ZP-3 and ZP-28) were screened out through the change of bran acidity and culture temperature with sensory evaluation score and esterifying power as the judging indexes.The addition of the intensified starter of ZP-3 and ZP-28 in distiller’s grains could evidently improve the accumulation time and the accumulation effects of distiller’s grains.

Key words:distiller’s grains;bran starter;bacteria;ester aroma;Baijiu

通訊作者：羅愛民，E-mail：luoam@scu.edu.cn。

作者簡介：陳劍（1992-），女，河南人，在讀碩士，食品科學，E-mail：heartchenjian@sina.com。

收稿日期：2015-10-27

基金項目：四川省科技廳基金項目(2015ZR0181)。

中圖分類號：TS262.3；TS261.1；TQ925.7

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）02-0061-04

DOI：10.13746/j.njkj.2015413

優先數字出版時間：2015-12-30；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20151230.0908.002.html。