濃香型白酒釀造中的酯化酶研究及應用進展

張楷正，黃　海（.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；.四川省釀酒研究所，四川廣漢68000）

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濃香型白酒釀造中的酯化酶研究及應用進展

張楷正1，黃海2
（1.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；2.四川省釀酒研究所，四川廣漢618000）

摘要：酯化酶是濃香型白酒生產上的重要酶類。概述了濃香型白酒生產中酯化酶的研究現狀，討論了酯化酶的反應特性、酯化酶技術在釀酒行業中的應用情況；同時，對當前酯化酶研究中存在的問題及其發展前景進行了討論與展望。

關鍵詞：濃香型白酒；酯化酶；研究進展

眾所周知，白酒中約2％的呈香呈味物質是決定酒體質量的重要物質。在香味物質中，酯類成分是其中的重要組成部分。許多白酒香型的劃分就是以主體酯類物質來區別的，如濃香型白酒以己酸乙酯為主體香、清香型白酒以乙酸乙酯為主體香。而酯類物質的合成——酯化，就是酸和醇反應，脫水而生成酯。在微生物體內溫和的環境中，此反應需有酯化酶的參與方能順利完成。

酯化酶不是酶學上的術語。酯化酶亦稱羧基酯酶,它是催化合成低級脂肪酸酯的酶類的總稱，白酒生產中是指脂肪酶、酯合成酶、磷酸酯酶的統稱[1]。該酶既能催化酯的合成，也能催化酯的分解。因此，白酒行業習慣分別稱為酯化酶和酯分解酶。酵母、霉菌、細菌中均含有酯酶。目前已經發現,紅曲霉、根霉中許多菌株有較強的己酸乙酯合成能力。酯化酶不同于酶學上的脂肪酶，脂肪酶的正式名稱是甘油酯水解酶。它既能將脂肪水解為脂肪酸和甘油,又能催化脂肪的合成，即脂肪酶是指水解一類特殊的酯類——三羧酸甘油酯的酶,而酯化酶則是可以水解羧酯鍵的酶。

酯化酶的理論基礎為酶在有機溶劑中作用，直接將酸與醇催化合成酯類，包括己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯等酯類物質，在白酒生產中已應用的多為乙酸乙酯合成酶及己酸乙酯合成酶，酯化酶對成品酒的風味同樣具有重要的影響。

1　酯化酶的酯化反應特性

酯化酶的反應特性與酯化微生物有關。一般認為，在釀酒微生物中酵母菌合成乙酸乙酯的能力較強；但在對己酸的酯化能力上，不同研究者有不同的看法：栗山一秀認為，酵母的酯化力遠遠大于曲霉的酯化能力，當酵母與曲霉共同作用時，則己酸乙酯產量大增[2]。“北斗試驗組”[3]認為，大曲對己酸的酯化能力優于麩曲，酵母的酯化能力并未表現出優越性，反而不及麩曲，這一點與吳衍庸的研究結果類似[4]。

大曲中的紅曲霉、白地霉、根霉和毛霉均具有酯化能力，且相同的酯化酶對不同的有機酸催化成酯的能力也不一樣。這完全可以理解，因為從生物化學方面講，凡是酶，其本質都是蛋白質（除自催化的核糖核酸酶外），在催化化學反應時均存在反應底物及產物、反應溫度、反應時間、反應環境的酸堿度和反應介質（反應溶劑類型）等因素的影響而導致產物或者產物生成量的不同。

1.1酯化酶催化的底物及產物種類

釀酒工業中酯化酶對酸底物特異性的研究主要是針對各香型白酒中的四大酯類的合成效果進行研究，主要底物是己酸、乙酸、丁酸和乳酸。

任道群等[5]對紅曲霉、大曲以及根霉菌對單一酸（乙酸、己酸、乳酸、丁酸）和混合酸（各酸等比混合）的酯化效果進行了研究，結果表明：紅曲霉能促進己酸、丁酸及混合酸與乙醇的酯化作用，生成的酯類物質均為己酸乙酯，而且酯化能力極強；大曲能促進己酸、丁酸及混合酸與乙醇的酯化作用，生成的酯類物質均為己酸乙酯，且能促進乙酸與乙醇的酯化生成乙酸乙酯；根霉能促進己酸和混合酸與乙醇的酯化作用，生成少量的己酸乙酯和乳酸乙酯。實驗表明，及時移出反應產物可促進酯化反應繼續進行。

杜禮泉等[6]對豐谷酒業保存的1株煙灰色紅曲霉酯酶的酯化特性的研究中發現，該紅曲霉酯酶對乙酸、丁酸、己酸都有較強的酯化作用,生成相應的乙酯，且紅曲霉酯酶是一類專一性很低的酶，屬于鍵專一性的生物酶，在濃香型大曲酒生產中能同時提高四大酯的含量。

唐玉明等[7]在對紅曲酯化菌21-3的特性研究中發現，四大酸和乙醇反應生成相應的乙酯，但是四大酸的混合物生成的物質為己酸乙酯。

由于酯化反應的底物為酸和醇類，兩者在酯化反應中不僅是底物，還都是酯化酶的變性劑。在低底物濃度范圍，己酸乙酯合成轉化率是隨著底物濃度的增加而增大的，這是因為增加底物濃度，可增加酶分子與底物作用的機會，加快反應速率。在生產實踐中，發現一般發酵正常的窖池，產酒多及酸高的，產酯也多，提高了酯化率；但底物濃度過大時，高濃度的酸和醇將影響酶結構的穩定，抑制反應的進行，轉化率及總酯含量會下降。

1.2酶促反應溫度

溫度是所有化學反應中的重要因素。酶促反應中酶能降低底物分子的活化能，在一定范圍內提高溫度能增加底物分子運動動能，增加底物分子相互碰撞及與酶接觸的機會，從而提高反應速度。但是隨著溫度的升高，一方面酶反應速度加快，另一方面酶蛋白的熱變性速度亦加快，因此，一個合適的反應溫度對酶促反應的進行有重要意義。

沱牌曲酒廠采取27℃、29℃、31℃、33℃和35℃共5個溫度值液態法發酵28 d（酸度4，酒精度9％vol），發現己酸乙酯的合成溫度以29℃為宜[8]。一般認為，酯化過程是在發酵后期進行的，即“前緩、中挺、后緩落”的“后緩落”階段。29℃比較符合濃香型白酒的發酵產酯生香情況。

1.3反應時間和反應介質

一般酯化酶催化的反應，時間長，所得酯類物質相對較高，比如“雙輪底”發酵的白酒所含呈香呈味物質就多于普通發酵白酒。2008年，成都邛崍某曲酒廠進行的“雙輪底”發酵生產濃香型酒，總酯含量由原來的0.73 g/100 mL提高到1.2 g/100 mL，總酸含量也有相應升高。

反應介質對酯化反應的速率也有較大影響。如在水相中需要100 h的酯化反應，在有機相（正庚烷）中只需24 h就能完成。與水相催化相比,有機介質可以增加酯化酶的熱穩定性,增加非極性底物的溶解度,減少反應副產物,還可能影響酶的底物特異性及酶反應的平衡方向和反應速度。有機溶劑相中酯化反應平衡點與反應速率同溶劑中水含量密切相關,有機溶劑作為反應介質時,在一個狹窄的初始含水量范圍內,酶有較高的催化酯化活力[9]。但在食品工業中，有機相溶劑的存在不利于簡化下游操作步驟，并存在有機溶劑污染食品問題。水相酯化反應雖然進行緩慢，但可以和實際生產相結合，可將酯化產品直接應用到生產中，簡單方便。所以應該根據不同目的，選用不同反應介質來進行酯化反應。

1.4反應環境的酸堿度

酯化反應的酸堿度或者反應的pH值對產酯效果影響較為顯著，一般應在較高酸度即較低的pH值下進行，大多數窖內或缸內發酵環境基本可滿足條件。以己酸乙酯合成為例，沱牌酒廠選取了2.5、3.0、3.5、4.0、4.5共5個不同酸度，在酒精度5％vol、溫度25℃時液態法發酵28 d，結果表明，己酸菌生長適宜酸度為3.0以下，而適宜的酯化酸度為4.0。

2　濃香型白酒釀造中應用的酯化酶技術

酯化酶技術的應用是中國白酒工業的一項重大創新成果，在白酒生產中應用的酯化酶制劑是生物酶和活菌體的生態混合體，在發酵過程既有傳統大曲的糖化功能，也有生香功能，從而可縮短發酵周期，提高出酒率和優品率[10]。

2.1酯化液串蒸

酯化液是將25％～30％的優質新鮮黃水和65％～70％的酒尾（10％vol～20％vol），再加入約2％的大曲粉、3％的酯化酶制劑、適量窖泥或窖泥培養液及底糟，倒入壇內，混勻，保溫發酵40 d，讓其進行緩慢酯化反應，即成酯化液粗品。

表1　酯化液串蒸酒體主要指標變化　(g/100mL)

酯化液粗品可以直接混入底鍋或撒至糧糟上進行串蒸，效果較好。李大和[11]試驗的酯化液串蒸效果見表1。

2.2酯化液灌窖

具體操作措施：將發酵成熟的酯化液粗品，在窖池主發酵結束后潑入加糧的酒醅中，再密封發酵60 d，出窖蒸餾。一般總酯含量可提高30％～50％。需要選擇窖泥質量好、不滲水的窖池，一般每甑灌入50 kg酯化液即可。同時注意，溫度較高的夏季不宜灌窖。

2.3高酯調味酒（液）的應用

將酯化液粗品進行三級過濾，最后精濾得到無色透明的高酯調味酒，或者將酯化液粗品注入分餾器，收集酒精含量60％vol以上的餾出液，可得香味濃郁的、己酸乙酯含量高達4～6 g/L的高酯調味酒，用于中、低檔成品酒的勾調，可使普通白酒向優質酒轉化。甘肅瀧西渭水酒業集團2003年引進酯化酶技術生產酯香液，用于中低檔成品酒的勾調，效果明顯好于外購香料[12]；吳衍庸[13]等開發的多功能復合香酯酶技術，在河南仰韶酒上應用，使用1 t由香酯酶生產的香酯液，可多出優質酒10 t。

2.4利用酯化酶制劑提高出酒率及優質品率

將酯化酶用于雙輪底發酵和回沙撒糟醅，可以較大地提高濃香型白酒中的總酯含量和優質品率，同時可以提高出酒率。王述榮等[14]研制的粗酶制劑YH-AM用于洋河大曲酒的生產，結果提高出酒率7.21％，提高優質酒率19.55％。信春暉等[15]在扳倒井大曲酒生產中添加復合酯化酶，平均出酒率提高6.7％，優質酒率提高7.3％；賈超英等[16]在泰山特曲生產中添加復合酯化酶，使優質酒率提高6.1％；王曉丹等[17]利用酯化紅曲霉FBKL 3.0018制成的酯化酶粗酶制劑，加入到濃香型清酒發酵中（1.5％），用曲量減少了2％～5％，出酒率提高了約2％；從微量成分含量分析，酒品質量明顯提高（表2）。

樊琪[18]在山東3株閣老貢酒生產中添加復合酯化酶，使出酒率提高5％，優質酒率為41.2％；束成忠等[19]研究為第1輪發酵后的優質酒率提高16.5％，第2輪發酵后的優質酒率提高6.2％。武建國等[20]以香醅為載體，加入紅曲酯化酶等材料，提高優質酒率7.2％～14％，己酸乙酯增幅在124.8～162.5mg/100 mL。

3　當前酯化酶研究中存在的問題與展望

酯化酶應用技術在濃香型白酒生產中極大地提高了優質酒的比例，同時也使出酒率得到提高；突出了濃香型白酒己酸乙酯的主體香，同時又使幾大酯的比例協調，窖香濃郁，酒體豐滿，醇和爽凈。雖然酯化酶技術漸趨成熟，但當前酯化酶研究中尚存在以下一些問題：

表2　添加酯化酶制劑及減曲的效果分析　（g/L）

（1）產酯微生物的選育仍需加強。尚需選育出適應性強、不易變異、酯香風格特點更為突出的菌株，包括酵母菌、霉菌等真菌。

（2）酯化酶的酶活及純度需要提高。酯化酶制劑大部分還停留在粗酶制劑階段，純度不高。今后應從提高酶純度入手，生產出商品酯化酶，形成一定的產業化規模，可滿足廣大釀酒企業的需要，提高優質酒的占比。

（3）在產酯能力提高的同時，應注意加大對白酒蒸餾環節提香作用的研究，使酒醅中酯香類物質得到較為充分的提取。

（4）在過濾蒸餾出合格的高酯調味酒后，酯化液中剩余的固形物，有待加強研究利用；同時應進一步研究酯化酶在水相中催化分解脂肪成甘油和高級脂肪酸，再形成高級脂肪酸酯的過程，以期達到對曲酒風味更為詳盡的解析。

4　結束語

酯化酶是濃香型白酒生產中的重要酶類，酶量的多少和酶活的高低，與白酒的優質品率密切相關。生產中采取多種方法并合理利用，可以提高出酒率和產品質量。當前應加大酯化酶催化過程的研究，選育風格特點突出的產酶微生物，提高酶制劑的純度及進行蒸餾提香過程的研究。

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Research Progress in and Application of Esterifying Enzyme in the Production of Nongxiang Baijiu

ZHANG Kaizheng1and HUANG Hai2
(1.College of Bioengineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong,Sichuan 643000;2.Sichuan Provincial Liquor-making Research Institute,Guanghan,Sichuan 618000,China)

Abstract:Esterifying enzyme plays an important role in the production of Nongxiang Baijiu.In this paper,the present research situations of esterifying enzyme were reviewed,including its reaction properties and its application in the production of Nongxiang Baijiu.Meanwhile,the prospects and the problems of esterifying enzyme in the research and in the application were discussed.

Key words:Nongxiang Baijiu;esterifying enzyme;research progress

作者簡介：張楷正（1969-），男，四川富順人，博士，副教授，主要從事發酵工程研究，E-mail：kai7766@126.com。

收稿日期：2015-07-27

基金項目：四川理工學院人才引進項目（2014RC26），瀘州老窖科研獎學金項目（13ljzk08），四川理工學院教改項目（JG-1527），四川理工學院大學生創新創業訓練計劃項目（201410622026）。

中圖分類號：TS262.3；TS261.4

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）02-0093-04

DOI：10.13746/j.njkj.2015322

優先數字出版時間：2015-10-23；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20151023.1400.004.html。