小鼠骨髓來源調節性樹突狀細胞的體外誘導分化及鑒定

王進京，袁晶華，喬磊，劉義，張曉寧，李克秋，李光

(天津醫科大學基礎醫學院，天津300070)

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小鼠骨髓來源調節性樹突狀細胞的體外誘導分化及鑒定

王進京，袁晶華，喬磊，劉義，張曉寧，李克秋，李光

(天津醫科大學基礎醫學院，天津300070)

摘要：目的建立小鼠骨髓來源調節性樹突狀細胞(DCreg)體外誘導培養和擴增的方法，并進行生物學及功能鑒定。方法取小鼠骨髓單個核細胞(BM-MNCs)，用重組小鼠白細胞介素4(rmIL-4)及重組小鼠粒-巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)誘導分化，第6天細胞中含大量DCreg；取部分細胞加脂多糖(LPS)，繼續培養2 d(第8天)分化為成熟DC(mDC)。觀察培養過程中細胞形態變化，流式細胞術檢測DCreg特異性表面分子CD11b和共刺激分子CD40、CD86。取小鼠脾臟分離的CD8+ T細胞，隨機分為3組；A、B組將細胞分別與DCreg、mDC以5∶1、10∶1、20∶1混合培養4 d，C組細胞不處理。采用CFSE標記法檢測CD8+ T細胞增殖情況，Real-time PCR檢測CD8+ T細胞免疫功能分子穿孔素(Prf1)和顆粒酶B(GzmB)mRNA。結果新分離的BM-MNCs呈圓形，體積較?。徽T導第6天細胞集落數量增多，體積增大，細胞表面突起增多,CD11b陽性細胞比例達96.1%±2.7%。與mDC相比，DCreg中CD40、CD86表達陽性率降低(P均<0.05)。與B組比較，A組細胞增殖率降低(P均<0.05)；與B、C組比較，A組Prf1、GzmB mRNA表達量降低(P均<0.05)，與C組比較，B組GzmB mRNA表達量升高(P均<0.05)。結論rmGM-CSF聯合rmIL-4可成功誘導小鼠BM-MNCs向DCreg分化，且純度高，并具有免疫抑制功能。

關鍵詞：調節性樹突狀細胞；器官移植；免疫耐受；細胞培養；穿孔素；顆粒酶B

肝移植是治療終末期肝衰竭最有效的手段，尋找誘導肝移植免疫耐受的有效方法是研究的熱點之一[1]。調節性樹突狀細胞(DCreg)又稱耐受性樹突細胞(DC)，多為未成熟狀態的樹突狀細胞(imDC)，表達低水平的MHC-Ⅱ類分子及共刺激分子(CD40、CD86等)，抗原吞噬能力極強，但活化T細胞的能力較弱，還能抑制免疫活化分子的分泌，促進調節性T細胞(Treg)增殖以誘導免疫耐受[2～4]。肝臟內含有大量DCreg[5]，探索其具體作用可為肝移植基礎研究與臨床應用提供新思路[6,7]。由于DCreg在體內含量低，且直接從體內分離既操作復雜又難以純化[8]，2014年12月～2015年6月，我們應用重組小鼠白細胞介素4(rmIL-4)聯合重組小鼠粒-巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)成功誘導小鼠骨髓來源單個核細胞(BM-MNCs)向DCreg分化和擴增，為進一步研究DCreg在肝移植免疫耐受中的作用奠定了基礎。

1材料與方法

1.1材料BM-MNCs分離自SPF級健康雄性C57BL/6小鼠(北京軍事醫學科學院實驗動物中心，6～8周齡，體質量18～20 g)，用含10% FBS的RPMI 1640培養基調整細胞密度為(1～2)×107/mL。主要試劑：RPMI 1640培養基及細胞培養板(美國Corning公司)；胎牛血清(FBS，以色列BI公司)；rmGM-CSF、rmIL-4(美國BD公司)；抗小鼠CD11b、CD40、CD86抗體及其同型對照抗體(美國eBioscience公司)；小鼠CD8磁珠及分選柱(德國Miltenyi公司)；免疫功能分子穿孔素(Prf1)和顆粒酶B(GzmB)基因引物由上海生工合成。

1.2方法

1.2.1小鼠BM-MNCs向DCreg的誘導分化與擴增將細胞以2×105/孔接種于12孔培養板，加入終濃度10 ng/mL的rmIL-4、20 ng/mL的rmGSM-CSF，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。第3、5天半量換液并補足細胞因子。培養第6天，輕輕吹洗細胞培養孔，收集半懸浮細胞及疏松貼壁細胞即為imDC(含大量DCreg)。取部分細胞加入1 μg/mL的脂多糖(LPS)，繼續培養2 d(第8天)即可分化為成熟DC(mDC)。

1.2.2細胞形態學觀察培養過程中，每天用倒置顯微鏡觀察所誘導培養DC的形態特點。

1.2.3DCreg細胞表型分析采用流式細胞術。分別收集培養第3、6、8 天的細胞，洗滌懸浮后標記熒光抗體：PE標記CD11b，FITC標記CD40和CD86(僅測第6、8 天的細胞)。流式細胞術檢測各表面標記物，以DCreg特異性分子CD11b陽性細胞所占比例表示其純度。

1.2.4DCreg免疫調節功能觀察采用混合淋巴細胞反應。①CD8+T淋巴細胞增殖觀察：采用羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)法。參考文獻[9]分離正常C57BL/6小鼠脾臟淋巴細胞，免疫磁珠法分選CD8+T細胞。CFSE標記CD8+T細胞，將細胞分為3組。A、B組將細胞分別與DCreg、mDC以不同比例(5∶1、10∶1、20∶1)加入96孔板混合培養，調整每孔培養液至200 μL；37 ℃、5% CO2共培養4 d；C組不處理。收集懸浮細胞，流式細胞術檢測CD8+T細胞的熒光值，以CFSE熒光強度減弱比率代表各組的增殖率。各組均設3個復孔，取平均值。②免疫功能分子Prf1和GzmB mRNA檢測：采用Real-time PCR法。收集混合淋巴細胞培養體系中的各組細胞，TRIzol法提取總RNA，經cDNA第一鏈合成試劑盒反轉錄為cDNA；Real-time PCR檢測細胞免疫功能分子Prf1和GzmB mRNA表達水平。Prf1基因引物上游為5′-CGGTGTCGTGTGGAACAATA-3′、下游為5′-TCATCATCCCAGCCGTAGTC-3′，產物長度為126 bp ；GzmB基因引物上游為5′-GACCCAGCAAGTCATCCCTA-3′、下游為5′-CCAGCCACATAGCACACATC-3′，產物長度為186 bp。并以GAPDH基因為內參照，以2-ΔΔCT法分析基因相對表達量。

2結果

2.1細胞形態學變化小鼠BM-MNCs經rmIL-4和rmGM-CSF聯合誘導24 h后，顯微鏡下可見多數細胞貼壁生長，體積較小，多為圓形，少部分懸浮生長；培養3 d后大量細胞集落形成，細胞數量顯著增多，細胞體積增大，形狀不規則，細胞表面出現短的毛刺樣突起，貼壁細胞減少，可見有突起的懸浮細胞；培養6 d時可見大部分為懸浮細胞，集落數增多，集落體積明顯增大，可見懸浮細胞表面有較多的短毛刺樣突起。加入LPS繼續培養2 d后，細胞集落呈分散狀態，細胞分布比較均勻，細胞表面突起明顯伸長，可見典型的較長的樹枝樣突起。

2.2DCreg細胞CD11b表達變化小鼠BM-MNCs培養第6、8天CD11b陽性表達率分別為96.1%±2.7%、90.5%±0.4%，高于培養第3天的69.1%±2.50%(P均<0.05)；第6、8天CD11b陽性表達率比較，P>0.05。

2.3DCreg細胞CD40和CD86表達變化小鼠BM-MNCs誘導培養第6天細胞CD40、CD86陽性表達率分別為21.2%±3.2%和18.7%±3.5%，第8天分別為66.9%±3.4%和70.9%±1.7%，P均<0.05。

2.4DCreg對CD8+T細胞增殖的影響見表1。

表1　DCreg對CD8+ T細胞增殖的影響

注：與A組同濃度比較，*P<0.05。

2.5DCreg對CD8+T細胞GzmB和Prf1 基因表達的影響見表2。

表2　各組CD8+ T細胞GzmB及Prf1 mRNA相對

注：與A組同濃度比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

3討論

肝移植排斥反應和免疫抑制劑不良反應嚴重影響移植物的長期存活，有效誘導肝移植免疫耐受是治療關鍵[10]。DC作為體內最強大的專職抗原提呈細胞，處于免疫反應的中心環節，不僅參與抗原特異性免疫反應的活化，還參與免疫耐受的建立和維持[11]。DC主要來源于CD34+造血干細胞，不同來源和不同分化階段的DC功能有一定差異[6]。目前研究表明，mDC可被炎癥信號激活，進而促進T細胞活化與增殖，誘導特異性T細胞反應；DCreg雖具有很強的抗原處理能力，但低表達CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ類分子，可抑制T細胞活化，具有促免疫耐受性調節功能[7,12]。有研究表明，骨髓來源的DCreg在同種異基因皮膚移植、腎移植和角膜移植中具有誘導免疫耐受和預防免疫排斥發生的作用[13～15]。

研究表明，骨髓來源的CD34+造血干細胞數量多且純度高，更適合體外誘導培養DCreg[16]。培養體系中細胞因子的種類和濃度決定了干細胞向不同譜系定向分化。本研究中的rmGM-CSF主要促進造血干細胞向DC定向分化，但還會向中性粒細胞和巨噬細胞分化，所以DC純度較低。由于rmIL-4能抑制造血干細胞向中性粒細胞和巨噬細胞分化，故聯合rmIL-4后可獲得數量較多、純度較高的DC[17]。

DC表面的共刺激分子不僅參與了細胞發育過程，還可以為免疫效應細胞的活化提供必需的共刺激信號，對免疫效應細胞的激活具有極其重要的作用[18]。本研究中，DCreg刺激同種異基因CD8+T細胞增殖的能力顯著低于mDC，可能是由于DCreg低表達共刺激分子CD86和CD40，導致CD8+T細胞增殖活化信號通路受阻[19]。進一步研究發現，與DCreg共培養的CD8+T細胞GzmB和Prf1 mRNA表達降低，而與mDC共培養的CD8+T細胞GzmB和Prf1 mRNA表達升高。表明共培養體系中DCreg能通過抑制GzmB和Prf1基因表達進而抑制CD8+T細胞的殺傷作用，其機制有待深入研究。

綜上所述，本研究聯合應用細胞因子rmGM-CSF和rmIL-4誘導小鼠BM-MNCs向DC定向分化和增殖，第6天即可獲得數量較多、純度較高、具有免疫調節功能的DCreg，實驗過程操作簡單，培養周期短，為進一步研究DCreg在肝移植免疫耐受誘導中的作用奠定了基礎。

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Induced differentiation and identification of mouse bone marrow-derived regulatory dendritic cells in vitro

WANGJinjing,YUANJinghua,QIAOLei,LIUYi,ZHANGXiaoning,LIKeqiu,LIGuang

(TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method for the induction and amplification of regulatory dendritic cells (DCreg) derived from mouse bone marrow in vitro, and to identify their biological and functional characteristics. MethodsThe bone marrow mononuclear cells (BM-MNCs) were induced to differentiate into DCreg by recombinant mouse IL-4 and recombinant murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rmGM-CSF). The cells collected on the sixth day contained a large number of DCreg. A portion of cells were cultured with lipopolysaccharide (LPS) for another 2 days to achieve the mature DC (mDC). The morphology of DCreg was observed by inverted microscope. The expression of CD40, CD11b and CD86 were detected by flow cytometry. The splenic CD8+ T cells were randomly divided into three groups: groups A, B and C. The cells in the group A and group B were incubated with DCreg or mDC at different ratios (5∶1, 10∶1, 20∶1) of mixture to culture for 4 days, and cells in the group C were not treated. We detected the proliferation of CD8+ T cells by the CFSE labeling. The expression of perforin (Prf1) and GzmB mRNA in CD8+ T cells was detected by real-time PCR. ResultsFreshly isolated MSCs were round with small volume. When induced for 6 days, much more cell colonies were found, and cells became larger with the increased cell surface projections. The positive cell percentage of CD11b was (96.1±2.7)%. Compared with mDC, the positive expression rates of CD40 and CD86 in DCreg were lower (all P<0.05). Compared with group B, the proliferation rate of group A was significantly decreased (all P<0.05). Compared with group C and group B, the expression of Prf1, GzmB mRNA of group A was reduced (all P<0.05). Compared with group C, the expression of GzmB mRNA in the group B was increased (all P<0.05).ConclusionsrmGM-CSF combined with rmIL-4 can induce the differentiation of BM-MNCs into DCreg successfully, which can obtain a large number of highly purified DCreg with immune suppressive function.

Key words:regulatory dendritic cells; organ transplantation; immune tolerance; cell culture; perforin; granzyme B

(收稿日期：2015-09-18)

中圖分類號：R392.4

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)10-0013-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.005

通信作者簡介：李光(1959-)，女，教授，主要研究方向為器官移植與免疫耐受。E-mail： lig@tmu.edu.cn

作者簡介：第一王進京(1975-)，男，講師，主要研究方向為移植免疫。E-mail： wangjinjingxml@163.com

基金項目：國家高技術研究發展計劃項目(2012AA021003)。