不同U87細(xì)胞數(shù)量對(duì)裸鼠原位惡性膠質(zhì)瘤模型構(gòu)建的影響

唐煥煥，沈曉燕，段小群，苑博，張艷群，張嫦麗，呂良

(1 桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西桂林541001；2復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院)

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不同U87細(xì)胞數(shù)量對(duì)裸鼠原位惡性膠質(zhì)瘤模型構(gòu)建的影響

唐煥煥1，沈曉燕2，段小群1，苑博1，張艷群1，張嫦麗1，呂良1

(1 桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西桂林541001；2復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院)

摘要：目的觀察不同數(shù)量的人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞對(duì)裸鼠原位惡性膠質(zhì)瘤模型構(gòu)建的影響。方法將20只裸鼠隨機(jī)分成A、B、C、D組各5只，于右側(cè)紋狀體分別注射0、0.05×105、0.2×105、1×105/μL的U87細(xì)胞懸液5 μL。接種前及接種后4周稱取體質(zhì)量，接種4周后取腦組織測(cè)量腫瘤體積，并行腦組織病理檢查。結(jié)果接種后4周，D組體質(zhì)量較A組降低(P<0.05)，其他組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A組無(wú)腫瘤形成，腦組織病理檢查未見(jiàn)異常；B、C、D組均可見(jiàn)腫瘤組織，細(xì)胞核中Ki-67蛋白表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性；腫瘤體積分別為(1.57 ±0.09)、(4.25 ±1.15)、(16.32 ±0.41)mm3，組間比較，P均<0.05。結(jié)論 U87細(xì)胞顱內(nèi)接種可構(gòu)建原位惡性膠質(zhì)瘤模型，且接種細(xì)胞數(shù)量越多建模效果越好。

關(guān)鍵詞：顱腦腫瘤；膠質(zhì)瘤；U87細(xì)胞；動(dòng)物模型

惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤[1]，惡性程度極高，發(fā)病迅速，病死率高[2]，傳統(tǒng)治療方法復(fù)發(fā)率高[3]。因此，建立一個(gè)成熟穩(wěn)定的惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，可為進(jìn)一步研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制及藥效學(xué)評(píng)價(jià)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。2014年10月～2015年3月，我們以不同濃度的人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87接種裸鼠，為診治惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的相關(guān)研究提供有用的動(dòng)物模型。

1材料與方法

1.1材料裸鼠20只，雌雄不限，5周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自湖南斯萊克公司； U87細(xì)胞購(gòu)于中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，DMEM培養(yǎng)基、青霉素鏈霉素雙抗(PS)、FBS、TrypLE(Gibco公司)，Envision免疫組化檢測(cè)試劑(Dako公司)，微量注射泵購(gòu)于KDS公司，抗人Ki-67抗體(1∶200)購(gòu)于BD公司，無(wú)菌骨蠟(上海三友公司)，小動(dòng)物腦立體定位儀(深圳瑞沃德公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將U87細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，用含10% FBS和1% PS的DMEM高糖培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～5 d更換培養(yǎng)液1次。待細(xì)胞融合率>80%時(shí)，按1∶5的比例傳代。

1.2.2分組與造模將裸鼠于SPF環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成4組各5只。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞，用TrypLE消化后離心，棄上清；PBS重懸沉淀，配成0、0.05×105、0.2×105、1×105/μL的細(xì)胞懸液。同時(shí)，將裸鼠麻醉后固定在小動(dòng)物腦立體定位儀上，夾好鼻夾，插入耳桿；作頭頂部正中切口，剝離骨膜，暴露出前囟；注射針頭對(duì)準(zhǔn)前囟點(diǎn)，將前后坐標(biāo)(AP)和左右坐標(biāo)(ML)調(diào)零。調(diào)節(jié)好AP和ML坐標(biāo)后，將針尖移至觸碰顱骨，最后將深度坐標(biāo)(DV)調(diào)零，裸鼠右側(cè)紋狀體的注射坐標(biāo)為AP -1 mm、ML -1.8 mm、DV -3.5 mm。A、B、C、D組分別應(yīng)用微量注射針直接注射0、0.05×105、0.2×105、1×105/μL的細(xì)胞懸液5 μL(細(xì)胞數(shù)分別為0、0.25×105、1×105、5×105個(gè))，速度設(shè)為1 μL/min。注射后留針3 min，緩慢出針，無(wú)菌骨蠟封閉骨孔，縫合皮膚，消毒傷口。

1.2.3體質(zhì)量檢查分別于接種前、接種后4周，稱取裸鼠體質(zhì)量。

1.2.4腫瘤組織病理檢查接種4周后麻醉動(dòng)物，在裸鼠心臟左心室插管灌注冰冷的PBS，取全腦；測(cè)量腦腫瘤體積[4]后置于4%甲醛溶液中固定24 h；常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片；行HE染色，觀察病理變化。免疫組化Envision兩步法檢查Ki-67，按試劑盒說(shuō)明操作。

2結(jié)果

2.1各組體質(zhì)量比較見(jiàn)表1。

表1　各組體質(zhì)量比較

注：與A組比較，*P<0.05。

2.2各組腫瘤組織病理檢查結(jié)果A組無(wú)腫瘤形成，腦組織病理檢查未見(jiàn)異常；其余組均有成瘤，B、C、D組腫瘤體積分別為(1.57±0.09)、(4.25±1.15)、(16.32±0.41)mm3，組間比較，P均<0.05。腫瘤組織與正常組織邊界明顯，染色較正常腦組織顏色深，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞排列密集，大部分細(xì)胞核中Ki-67蛋白表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性。

3討論

目前，已相繼建立了多種膠質(zhì)瘤模型，包括同種異位模型[5,6]、同種原位模型[7,8]、異種異位模型[9]和異種原位模型[10,11]等。其中，裸鼠皮下移植瘤模型操作簡(jiǎn)單，便于觀察，但皮下種植的膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)到第15天左右會(huì)停止生長(zhǎng)或生長(zhǎng)緩慢[12]，且皮下瘤無(wú)法評(píng)價(jià)藥物是否可以通過(guò)血腦屏障。因此，原位膠質(zhì)瘤更能真實(shí)反映腫瘤在顱內(nèi)生長(zhǎng)的真實(shí)狀態(tài)，更具研究?jī)r(jià)值。原位移植的建立較為復(fù)雜，存在觀察困難的問(wèn)題。我們利用小動(dòng)物腦立體定向儀定向操作，使定位準(zhǔn)確。有研究表明，進(jìn)樣速度會(huì)影響腫瘤的形態(tài)[13]。因此，我們使用了可以調(diào)控進(jìn)樣速度的微量進(jìn)樣泵，嚴(yán)格控制進(jìn)樣速度。

本研究結(jié)果顯示，接種后4周，D組體質(zhì)量較A組降低，其他各組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A組無(wú)腫瘤形成，腦組織病理檢查未見(jiàn)異常；B、C、D組均可見(jiàn)腫瘤組織細(xì)胞，細(xì)胞核中Ki-67蛋白表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性；腫瘤體積與細(xì)胞數(shù)量成正比，其中以5×105個(gè)接種數(shù)為最佳。這與國(guó)外研究報(bào)道得到的結(jié)果相近似[14,15]。本研究成功構(gòu)建原位惡性膠質(zhì)瘤模型，對(duì)于同行具有借鑒意義，為下一步研究工作的開(kāi)展打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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(收稿日期：2015-10-22)

中圖分類號(hào)：739.41

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)10-0029-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.011

通信作者：呂良(E-mail: luliang998@163.com)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460619)；廣西自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目(2015 GXNSFBA 139178)。