缺血預(yù)處理對大鼠腦組織及血清氨基酸水平的影響

王小琴，鄒玉安，薛茜,田莉，魏孟琳

(1河北北方學(xué)院，河北張家口075000；2河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院)

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缺血預(yù)處理對大鼠腦組織及血清氨基酸水平的影響

王小琴1，鄒玉安2，薛茜2,田莉1，魏孟琳1

(1河北北方學(xué)院，河北張家口075000；2河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院)

摘要：目的觀察缺血預(yù)處理(CIP)對大鼠腦組織及血清天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)水平的影響。方法 將90只SD大鼠隨機分為3組各30只,A組短暫性阻斷雙側(cè)頸總動脈行CIP處理， B組不阻斷血流,C組不處理。CIP后1、3、6、12、24 h，采用高效液相色譜法檢測腦組織及血清中的Glu、Asp、GABA、Gly。結(jié)果與B、C組同時點比較，A組腦組織與血清中Glu、Asp、GABA、Gly均增高(P均<0.05或0.01), 1 h或3 h達(dá)高峰，3 h或6 h后開始逐漸下降, 24 h恢復(fù)正常水平。結(jié)論 CIP后大鼠腦組織及血清Glu、Asp、Gly、GABA升高，這可能是早期腦缺血耐受機制的啟動因素。

關(guān)鍵詞：腦缺血；預(yù)處理；天冬氨酸；谷氨酸；γ-氨基丁酸；甘氨酸

缺血預(yù)處理(CIP)是預(yù)先給予大腦一次或多次短暫的、亞致死性的缺血，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)機制從而對抗隨后更嚴(yán)重的缺血損傷[1]，但其具體機制仍未闡明。以往研究發(fā)現(xiàn)，興奮性氨基酸在腦缺血再灌注損傷中起重要作用[2]。2014年9月～2015年8月，我們觀察了CIP對大鼠腦組織及血清天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(Gly)水平的影響，為缺血缺氧性腦病的防治提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料成年雄性SD大鼠90只，SPF/UAF級，體質(zhì)量(250±10)g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。e2695 高效液相色譜儀(美國Waters公司)，HypersilC18色譜柱(美國Thermo公司)，2,4-二硝基氟苯(DNFB，成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司)，4種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度均>98%，上海源葉生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組與處理90只大鼠禁食但自由飲水24 h，隨機分為3組各30只。A組水合氯醛350 mg/kg麻醉，仰臥位固定，根據(jù)改良兩血管閉塞(2VO)法[3]行CIP處理，即短暫性阻斷雙側(cè)頸總動脈；B組處理同A組，但不阻斷血流；C組不處理。

1.2.2標(biāo)本獲取CIP后1、3、6、12、24 h每組各取6只，腹腔注射麻醉后迅速腹主動脈取血3 mL，低溫離心15 min后取上清，-80 ℃冰箱備用。同時迅速冰盤上斷頭取腦，稱重，加入9倍量的0～4 ℃生理鹽水；在冰水浴上機械勻漿得10%腦組織勻漿，低溫離心取上清，-80 ℃冰箱備用。

1.2.3腦組織及血清氨基酸測定采用高效液相色譜法。色譜條件：流動相A為甲醇，流動相B為0.015 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH 6.0), 0.45 μm濾膜過濾，超聲脫氣20 min；流速1 mL/min，檢測波長360 nm，柱溫30 ℃；進(jìn)樣10 μL進(jìn)行梯度洗脫，采用外標(biāo)法定量分析。

取出標(biāo)本后復(fù)溶，低溫高速離心，取上清液400 μL；加入乙腈400 μL，漩渦混勻1 min，低溫12 000 r/min離心10 min去除蛋白；取上清液加入0.5 mol/L碳酸氫鈉400 μL和 0.5% DNFB 200 μL，漩渦混勻，55 ℃下暗中衍生60 min，進(jìn)樣10 μL[4]。

2結(jié)果

CIP后不同時點各組大鼠腦組織及血清中氨基酸水平比較，見表1。

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，隨腦缺血再灌注損傷加重，腦內(nèi)興奮性氨基酸(Glu、Asp、Gly)水平會逐漸升高甚至達(dá)基

表1　CIP后不同時點各組大鼠腦組織及血清中氨基酸水平比較±s)

注：與B、C組同時點比較,*P<0.05，△P<0.01。礎(chǔ)水平的數(shù)十倍，而相應(yīng)的腦梗死體積逐漸增大,即興奮性氨基酸的毒性呈現(xiàn)劑量依賴性[5]。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CIP后A組大鼠血清及腦組織中4種氨基酸均升高，以興奮性氨基酸升高最顯著。表明采用溫和的腦缺血方式，不但不會引起神經(jīng)元的嚴(yán)重?fù)p傷,還可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生內(nèi)源性的保護(hù)機制。當(dāng)下次更嚴(yán)重的缺血缺氧損傷到來時，雖然興奮性氨基酸大量增加，但機體內(nèi)源性的保護(hù)機制已被調(diào)動。例如，CIP后增加的Glu可能促使興奮性氨基酸向抑制性氨基酸轉(zhuǎn)化[2]，激活星型膠質(zhì)細(xì)胞，可上調(diào)Glu轉(zhuǎn)運體表達(dá)[6，7]、下調(diào)Glu受體(NMDA、AMPA),抑制Glu釋放等來降低其興奮毒性；此外，Glu還可以促進(jìn)谷胱甘肽合成，產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激作用等[8，9]。這與 Badawi等[10]的研究結(jié)果一致。CIP后增加的Gly可以使神經(jīng)細(xì)胞膜超極化，進(jìn)而抑制NMDA受體通道開放，降低Gly對神經(jīng)元的興奮毒性[11，12]。因此，CIP后大鼠腦組織及血清中氨基酸水平升高，可能是早期腦缺血耐受的啟動因素。

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(收稿日期：2015-10-09)

中圖分類號：R332

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)10-0031-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.012

通信作者：鄒玉安(E-mail： zya8857111@sohu.com)

基金項目：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃項目(20090591)。