基于ISSR標記的10份紫蘇種質資源的遺傳多樣性評價

陳俊錕，王力軍，沈 奇，郭鳳根，王仙萍，田世剛

（1．貴州省油菜研究所，貴州貴陽550008；2．中國農業科學院油料所芝麻與特色油料研究室，湖北武漢430062；3．云南農業大學農學與生物技術學院，云南昆明650201）

基于ISSR標記的10份紫蘇種質資源的遺傳多樣性評價

陳俊錕1，王力軍2，沈 奇1，郭鳳根3＊，王仙萍1，田世剛1

（1．貴州省油菜研究所，貴州貴陽550008；2．中國農業科學院油料所芝麻與特色油料研究室，湖北武漢430062；3．云南農業大學農學與生物技術學院，云南昆明650201）

為紫蘇屬植物的種群結構、遺傳多樣性和進化分類系統研究及種質資源的保護與開發利用提供依據，筆者采用ISSR標記對表型鑒選的10份具有典型植物學性狀、來源于不同生態區域的紫蘇屬植物種系分類進行研究。結果表明：采用ISSR引物進行擴增共獲得多態性條帶266個，平均多態性比率為56．74%。10份材料間遺傳距離為0．690 4～0．975 6，遺傳一致度為0．024 7～0．370 4。10份紫蘇種質資源可分為2大類群，每個類群包括2個變種。

紫蘇屬植物；ISSR標記；遺傳距離；聚類分析；進化分類

紫蘇（Perilla frutescens）又名蘇子、蘇麻、引子和荏，為唇形科（Labiatae）紫蘇屬（Perilla）1年生草本植物［1－2］。紫蘇是我國傳統的藥食兼用型植物，在醫藥、食品及保健等領域具有廣泛用途［3］。目前，國內外學者對紫蘇屬植物分類系統上仍存在爭議。《中國植物志》將紫蘇屬植物定義為1種3變種，其中，紫蘇〔P．frutescens var．frutescens（L．）〕為原變種，紫蘇與白蘇的變異是因栽培而起，差別細微，應將二者合并；其他3個變種為野生紫蘇（P．frutescens var．acuta），耳齒變種（P．frutescens var．auriculato－dentata）和回回蘇（P．frutescens var．crispa）［4］。劉月秀等［5－6］通過植物學性狀及核型分析將我國紫蘇屬植物鑒定為4個變種，將白蘇與紫蘇區分為2個不同的變種，即白蘇（P．frutescens var．frutescens）、紫蘇（P．frutescens var．frutescens）、回回蘇（P．frutescens var．crispa）和野生紫蘇（P．frutescens var．purpurascens）。郭鳳根等［7－10］運用同工酶電泳及45SrDNA FISH、ISSR標記對云南境內紫蘇進行研究，提出將其劃分為5個變種的說法，分別為野生紫蘇變種（P．frutescens var．purpurascens）、耳齒紫蘇變種（P．frutescens var．auriculato－dentata）、白蘇變種（P．frutescens var．frutescens）、回回蘇變種（P．frutescens var．crispa）和紫蘇變種（P．frutescens var．arguta）。胡彥［11］對我國34份紫蘇種質資源的植物學形態及花粉粒形態進行觀察，支持紫蘇屬植物分為5個變種的劃分方法。Lee J K等［1］利用AFLP標記鑒定東亞60份紫蘇種質的遺傳關系認為，紫蘇植物可分為（P．frutescens var．frutescens Britt．）（油用）及（P．frutescens var．crispaDecaisne）（藥用及菜用）2大類群，其分別具有近源的野生種。Nitta M等［2－3］采用RAPD標記鑒定來源于韓國、日本、尼泊爾和越南等地的紫蘇；Park Y J等［12］采用SSR標記鑒定來源于韓國及日本的104份紫蘇種質資源，Lee M C等［13］用SCAR標記鑒定紫蘇類群的多態性。但目前為止，紫蘇屬植物的分類系統仍無明確結論。隨著分子生物學的發展，基于分子標記的基因分型技術已作為重要的研究手段廣泛應用于植物分類及遺傳多樣性鑒定［14－15］。當前，分子標記類型已經發展到數十種，在重要物種中，已獲得大量可靠及穩定的標記，對植物進化、鑒選及育種等研究起到較大的推動作用［16－19］。對于紫蘇屬植物而言，涉及的標記類型較為狹窄，目前僅有AFLP、RAPD、SSR、ISSR 和SCAR等幾類傳統的標記類型運用于紫蘇研究，且涉及標記數量較少，遠不能滿足目前研究及應用的需要［8，20－21］。紫蘇分子標記的開發仍是分類鑒定中亟需解決的關鍵問題［20－21］。ISSR（inter－simple sequence repeat）標記是1994年由加拿大哥倫比亞大學大學提出的標記類型。該標記實驗操作簡單，遺傳多態性高，重復性好，目前已廣泛使用于植物進化，分類和遺傳多樣性研究［15］。筆者采用ISSR標記對通過表型鑒選的10份具有典型植物學性狀并來源不同生態區域紫蘇屬植物種質進行分類研究，以期為紫蘇屬植物的種群結構、遺傳多樣性和進化分類系統研究及種質資源的開發利用提供依據。

1材料與方法

1．1供試材料

1．1．1紫蘇種質10份紫蘇種質資源由貴州省油菜研究所提供，包括貴州5份，日本1份，湖南1份，湖北2份，黑龍江1份。該供試材料為貴州省油菜研究所2010—2013年收集到的200余份紫蘇種質資源，經過2年田間種植及性狀調查，從中挑選出的具有典型植物學性狀且來源于不同生態區域的材料。

1．1．2ISSR引物 供試的27條ISSR引物來源于加拿大哥倫比亞大學Ziekiewicz設計并公布的ISSR引物序列。

1．1．3試劑dNTPs、MgCl2、Taq DNA聚合酶等購自上海生工生物工程公司。

1．2試驗方法

1．2．1紫蘇植物學性狀調查 供試紫蘇種質資源于2013年3月播種于貴州省油菜研究所試驗田，5月上旬按行窩距50cm×30cm移栽定植，正常水肥管理。參照文獻［22］的方法并根據田間觀察需要對紫蘇種質資源植物學性狀進行調查。調查按照苗期葉色（分正面、背面、葉脈、心葉及莖色分別記載），現序期性狀（按形狀、大小、絨毛、鋸齒、褶皺、耳齒及苞葉分別記載），花色性狀（按花冠及雄蕊顏色分別記載），種子性狀（按顏色及大小記載）進行記載。

1．2．2紫蘇DNA的提取 采用CTAB法提取材料DNA。

1．2．3ISSR－PCR擴增體系及電泳 根據加拿大Ziekiewicz報道ISSR引物序列，并參照文獻［15，23－24］報道的在唇形科中主要使用的ISSR引物合成引物對10份紫蘇種質資源進行擴增。ISSR反應體系為（10μL）：1μL 10×buffer，0．4μL dNTP Mixture（10mM），2μL Primer（10μM），0．1μL Taq（5U／μL），1μg DNA模板，ddH2O補足10μL。擴增條件：94℃3min；94℃30s；引物最適退火溫度30s；72℃60s；步驟2～4進行38個循環擴增；72℃7min。擴增產物取2μL進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1．2．4紫蘇種質資源的聚類分析 利用NTSYS－pc（2．1）對所獲得的原始數據矩陣進行處將原始數據標準化（STD）后，計算紫蘇種質資源及各居群間的歐氏距離數理（Euclidean distance），采用非加權組平均法（UPGMA）進行Q型種質聚類，繪制聚類圖。

1．3數據統計與分析

根據ISSR擴增條帶有無分別以1和0表示，構成原始數據矩陣。用POPGENE計算不同地區的遺傳多樣性指數等指標，分析不同材料之間Nei’s遺傳距離和遺傳一致度。

2結果與分析

2．1紫蘇種質資源的植物學性狀

從表1可知，10份紫蘇種質資源材料的植物學性狀存在差異。其中，Pf2及Pf9的葉色全紫，Pf8為全綠，其余均為正綠背紫。葉形包括卵圓、心形及不規則形。葉片大小及絨毛均有差異。2份材料（Pf8及Pf9）呈現較深的鋸齒和褶皺，其余較平滑。Pf3及Pf5呈現顯著的苞葉。花色和雄蕊顏色分別呈現白、粉紅和紫紅。種子顏色分別呈現灰白、褐、紅褐和灰褐。種子大小也呈現較大差異。表明，10份材料是具有紫蘇典型植物學性狀代表的材料，并覆蓋不同生態區域，具有較強代表性，可用作ISSR引物篩選和紫蘇分類鑒定。

2．2ISSR標記引物擴增及多態性

從表2可知，經ISSR標記引物擴增共篩選出27對多態性強、重復性好的引物用于10份紫蘇代表性材料進行PCR擴增。2 7對ISSR引物在供試10份材料中共獲得擴增條帶496條。其中，具有多態性條帶共266條，平均每條引物獲得多態性條帶9．48條，平均多態性比率為56．74%。

表1 10份紫蘇種質資源的植物學性狀Table 1 The botanical characters of the 10 Perillagermplasm resources

表2 10份紫蘇屬植物的ISSR標記引物及擴增多態性Table 2 ISSR primer and amplification polymorphism

2．3紫蘇的遺傳多樣性

從表3可知，10份紫蘇種質資源的遺傳距離為0．690 4～0．975 6，平均遺傳距離為0．848 5；遺傳一致度為0．024 7～0．370 4，平均遺傳距離為0．170 6。親緣關系最遠的是Pf2與Pf9號材料，其遺傳距離數值最大，為0．975 6，遺傳一致度數值最小，為0．024 7。親緣關系最近的是Pf2與Pf4號材料，其遺傳距離數值最小，為0．690 4，遺傳一致度數值最大，為0．370 4。

表3 10份紫蘇種質資源遺傳一致度及遺傳距離Table 3 Genetic distance（below diagonal）and genetic coherence（above diagonal）of the 10 Perillagermplasm resources

圖1 10份紫蘇種質資源的聚類Fig．1 Cluster analysis chart of the 10 Perilla germplasm resources

2．4紫蘇種質資源的聚類

從圖1可知，利用UPGMA法構建10份紫蘇種質資源的遺傳關系聚類圖，其遺傳相似性在0．55水平上，10份紫蘇種質資源可分為2個類群；在遺傳距離0．68水平上，2個類群又可分別分為2組。其中，I－1主要性狀為株高較高，葉片較大，莖葉絨毛重，香氣淡，葉片兩面綠或正綠背紫，種子大，以油用型紫蘇為主。I－2主要性狀為植株較矮，葉片較小，分枝及葉多，香味濃郁，葉片兩面紫或正綠背紫，葉脈紫，種子小，小堅果堅硬，以藥用食用紫蘇為主。II－1植株較矮，性狀表現：1）心葉心型或不規則，果萼苞葉大；2）為葉正綠背深紫色，葉脈深紫色。二者的共同特點為種子大，小堅果較脆；植株抗性差，病害重；多作油用型紫蘇，但產量及抗性等性狀需要改良。II－2性狀為葉片邊緣具狹而深的鋸齒，葉型不規則，表面多有皺折，葉兩面皆綠或紫，種子小，小堅果堅硬，多做藥用食用類紫蘇。

2．5紫蘇種系的分類

根據10份紫蘇種質資源的植物學特征及分子標記聚類結果對其種系分類（各變種）歸納如下：紫蘇屬植物可分為2大類群。但根據分子標記聚類結果應對該類群劃分進行相應調整。第1類群包括紫蘇原變種（P．frutescens var．frutescens）及紫蘇變種（P．frutescens var．purpurascens）；第2類群包括野生紫蘇變種（P．frutescens var．arguta）及回回蘇變種〔P．frutescens（L．）Britt．var．crispa〕（圖2）。

圖2 紫蘇屬植物代表性小種照片Fig．2 Photos of representative species of Perilla plants

3結論與討論

采用27對ISSR標記對供試材料進行擴增共獲得多態性條帶266條。表明，ISSR標記在紫蘇屬植物中遺傳多態性高，重復性好，是一類較好的可應用于紫蘇屬植物分型研究的標記類型。對紫蘇的ISSR分子標記可為紫蘇屬植物材料的分類研究提供可應用的分子標記。

筆者收集貴州省及國內外紫蘇種質資源200余份，根據其植物學特征鑒選10份代表性材料進行ISSR擴增，并結合中國植物志及國內學者對變種劃分的結果與Lee J K等［1］的結果相似，即紫蘇屬植物可分為2大類群，2大類群分別包含2個變種。種間親緣關系標記聚類結果，第1類群包括紫蘇原變種（P．frutescens var．frutescens）及紫蘇變種（P．frutescens var．purpurascens）；第2類群包括野生紫蘇變種（P．frutescens var．arguta）及回回蘇變種〔P．frutescens（L．）Britt．var．crispa〕。這與國際上報道的對紫蘇類群中栽培種（紫蘇原變種）及野生種（回回蘇）的定義較為相似。

根據ISSR聚類研究結果將貴州地區紫蘇資源歸于I類，而其他地區紫蘇資源歸于II類，體現了資源地域性的差異。該結果可能與供試樣品的人為選擇及數量不足有關，有待通過已發展的標記對更多資源進行鑒定獲得更全面的結果。但就目前的研究結果看，貴州地區分布資源主要以I類為主，尤其在油用紫蘇資源方面，貴州地區資源具有植株高大，豐產性好，含油量高及抗性強等優良性狀。研究結果對貴州紫蘇在紫蘇屬植物的進化地位評價及資源綜合開發利用方面具有指導意義。

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（責任編輯：王 海）

Genetic Diversity Assessment of 10 Perilla Germplasm Resources based on ISSR Marker

CHEN Junkun1，WANG Lijun2，SHEN Qi1，GUO Fenggen3＊，WANG Xianping1，TIAN Shigang1
（1．Guizhou Rapeseed Institute，Guiyang，Guizhou550008；2．Oil Crops Research Institute Sesame and Special Oil Crops Research Office，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Wuhan，Hubei 430062；3．College of Agronomy and Biotechnology，Yunnan Agriculture University，Kunming，Yunnan 650201，China）

For studying on population structure，genetic diversity and evolution classification system of Perillaplants and provide references for protection and exploitation of the Perilla germplasm resources，10 Perilla germplasm resource materials possessing various phenotypic characters from different areas were selected to done PCR amplification by using ISSR marker primers．Results：A total of 266 polymorphic bands were finally acquired．The average polymorphic rate was 56．74%．The variation range of genetic distance from 10materials was 0．690 4～0．975 6，and variation range of genetic coherence was 0．024 7～0．370 4．The Perilla materials were classified into two groups，two variants included in each group．

Perillaplants；ISSR marker；genetic distance；cluster analysis；taxonomy

S542＋．9；Q37

A

1001－3601（2016）12－0492－0010－05

2016－07－03；2016－11－28修回

國家自然科學基金項目“紫蘇屬植物進化與種群結構研究以及貴州紫蘇資源遺傳多樣性評價”（31360067）；貴州省科學技術基金項目“貴州紫蘇屬植物SSR標記開發與資源鑒選”［黔科合J字（2014）2020］；貴州省農業科學院專項資金項目“紫蘇資源品質研究中近紅外光譜分析模型的創建和應用”［黔科合農科院院專項（2011）017］；貴州省科技廳省農科院聯合基金項目“轉錄組及脂肪酸代謝共表達分析揭示紫蘇α－亞麻酸合成及調控機理”［黔科合LH字（2015）7062］

陳俊錕（1972－），男，農藝師，從事油料作物遺傳與育種研究。E－mail：1521510633＠qq．com

＊通訊作者：郭鳳根（1964－），男，教授，博士生導師，從事植物資源的評價與利用研究。E－mail：yngfg＠sina．cn