茅臺(tái)醬香型酒曲中黃酮、多酚含量的測(cè)定

王興東，牟明月，楊毓溥，楊承月，李夢(mèng)潔，張前軍，周清娣，衛(wèi)　鋼（1.貴州大學(xué)精細(xì)化工研究開(kāi)發(fā)中心，貴州貴陽(yáng)00；.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽(yáng)00；.貴州茅臺(tái)酒股份有限公司，貴州仁懷601；.澳大利亞悉尼大學(xué)化學(xué)學(xué)院，澳大利亞悉尼1797；.澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織材料科學(xué)與工程，澳大利亞新南威爾士州070）

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茅臺(tái)醬香型酒曲中黃酮、多酚含量的測(cè)定

王興東1，2，牟明月3，楊毓溥2，楊承月2，李夢(mèng)潔2，張前軍2，周清娣4，衛(wèi)鋼5
（1.貴州大學(xué)精細(xì)化工研究開(kāi)發(fā)中心，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；3.貴州茅臺(tái)酒股份有限公司，貴州仁懷564501；4.澳大利亞悉尼大學(xué)化學(xué)學(xué)院，澳大利亞悉尼1797；5.澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織材料科學(xué)與工程，澳大利亞新南威爾士州2070）

摘要：建立醬香型酒曲中總黃酮、多酚含量測(cè)定方法。以槲皮素為對(duì)照品，采用紫外分光光度法測(cè)定茅臺(tái)醬香型酒曲中總黃酮含量；以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，用Folin-Ciocateau比色法測(cè)定酒曲中多酚含量。結(jié)果表明，槲皮素及沒(méi)食子酸對(duì)照品分別在濃度0.0210～0.1050 g/L( r= 0.9976)和0.00051～0.00565 g/L( r =0. 9997)范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系，茅臺(tái)醬香型酒曲中黃酮和多酚含量分別為9.70 mg/g和1.84 mg/g。此方法簡(jiǎn)便易行，重現(xiàn)性好，結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確，適用于醬香型酒曲總黃酮和多酚的定量測(cè)定。

關(guān)鍵詞：醬香型酒曲；黃酮；多酚；分光光度法；Folin-Ciocateau法

酒曲是以米粉或麩皮等作為原料，接入母曲，在控制溫度和濕度的條件下制成的[1]。茅臺(tái)醬香型酒曲在制備過(guò)程中，赤水河流域特有的微生物群在曲坯上生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生了各種各樣復(fù)雜的生物化學(xué)變化，并形成各種代謝物，對(duì)白酒風(fēng)味、質(zhì)量起著重要作用。目前有關(guān)酒曲研究主要為酒曲中的酶系分析，化學(xué)成分研究報(bào)道很少，因此，本研究對(duì)茅臺(tái)醬香型酒曲的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期闡明茅臺(tái)醬香型酒曲的物質(zhì)基礎(chǔ)，為酒曲應(yīng)用提供參考性依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

原料：茅臺(tái)醬香型酒曲（產(chǎn)自貴州省仁懷市茅臺(tái)鎮(zhèn)）。

試劑：槲皮素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品藥物檢定所），沒(méi)食子酸（貴州迪大生物有限公司），水為重蒸水，硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、磷酸、碳酸鈉、濃鹽酸和溴水；其他試劑均為分析純。

儀器設(shè)備：紫外分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）。

1.2黃酮含量測(cè)定方法

1.2.1供試品溶液制備

稱取酒曲5.000 g于250 mL的圓底燒瓶中，加入150 mL 75 %vol乙醇回流2 h，回流3次，將3次濾液合并，旋干，用60 %vol的乙醇溶液溶解，置于100 mL容量瓶中，補(bǔ)加60 %vol乙醇溶液至刻度，搖勻，作為供試品溶液[2]。

1.2.2槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作[3]

精密稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品0.0208 g，用60 %的乙醇定容于100 mL容量瓶中，得0.207 g/L的對(duì)照品溶液。

分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0 mL、2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL、10.0 mL、12.5 mL，置于25 mL容量瓶中，前5瓶補(bǔ)加60 %vol的乙醇至12.5 mL。再加5 % NaNO20.75 mL，搖勻，放置5 min，加入10 % Al（NO3）30.75 mL，搖勻，放置5 min，加入4 % NaOH 10 mL；分別用60 %vol的乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min[4]。以第一瓶做空白，在510 nm處分別測(cè)其吸光度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=5.2150x+0.0064(R2=0.9979)。槲皮素對(duì)照品在0.0210～0.1050 g/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液5.0 mL置于25 mL的容量瓶中，參照1.2.2方法配制后分別放置0 min、15 min、30 min、45 min、60 min后測(cè)定吸光度，分別為0.507、0.501、0.510、0.501、0.505，RSD為0.77 %。說(shuō)明供試品溶液制備后1 h內(nèi)穩(wěn)定，吸光度無(wú)明顯變化。

1.2.4精密度測(cè)定

取同一供試品溶液5.0 mL共5份，參照1.2.2方法配制后以不加供試品的相應(yīng)溶液作為空白試劑，測(cè)定其吸光度，分別為0.510、0.509、0.505、0.510、0.511。RSD為0.46 %，說(shuō)明該方法測(cè)定醬香型酒曲總黃酮含量精密度良好。

1.2.5重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批酒曲5份，每份5.000 g，重復(fù)1.2.1步驟得到待用供試品溶液，取5.0 mL溶液置于25 mL的容量瓶中，參照1.2.2方法配制后，以不加供試品的相應(yīng)溶液作為空白試劑，測(cè)量其吸光度，分別為0.510、0.490、0.530、0.521、0.510，吸光度平均值為0.512，黃酮含量的平均值為9.695 mg/g，RSD為1.77 %。表明該方法測(cè)定醬香型酒曲總黃酮含量重現(xiàn)性良好。

1.2.6加樣回收試驗(yàn)[4]

稱取同一批酒曲5份，每份2.5000 g，參照1.2.1步驟得到待用供試品溶液，稱取25.0 mg對(duì)照品配制成100 mL的溶液，分別從5份供試品中吸取5.0 mL置于25 mL容量瓶中，再分別吸取5.0 mL的對(duì)照品置于上述5瓶溶液中，依照1.2.2方法配制后以不加供試品和對(duì)照品的相應(yīng)溶液作為空白試劑，測(cè)定其吸光度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　黃酮加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.3總酚含量測(cè)定

1.3.1供試品的制備

酒曲干燥粉碎后稱取約2 g置于100 mL容量瓶中，加入30 mL無(wú)水乙醇，加熱回流10 h，抽濾后減壓濃縮成浸膏，用無(wú)水乙醇溶解至100 mL容量瓶，過(guò)濾，濾液作為供試品溶液[5]。

1.3.2福林酚試劑的制備（FC試劑）

稱取鎢酸鈉25 g、鉬酸鈉6.25 g，然后加175 mL的水、12.5 mL的85 %磷酸、25 mL濃鹽酸，置于500 mL的圓底燒瓶中，加入沸石，加熱回流10 h，冷卻，再加硫酸鋰37.5 g、水12.5 mL和溴水適量，加熱煮沸15 min，得金黃色溶液，冷卻，過(guò)濾至250 mL的棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度。臨用前加水1倍，搖勻[6]。

1.3.3對(duì)照品溶液的制備

精密稱取沒(méi)食子酸0.0257 g，用60 %vol乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中，用60 %vol乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.257 g/L儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)品溶液[6]。

1.3.4顯色條件的確定[6]

(1) FC試劑體積的確定。精密吸取沒(méi)食子酸0.2 mL 6份分別置于25 mL容量瓶中，其中5瓶分別加入1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL FC試劑和4.0 mL 10 %Na2CO3溶液，蒸餾水定容，搖勻，在室溫下顯色40 min，以相應(yīng)溶液為空白試劑，在765 nm處測(cè)定吸光度。

(2) Na2CO3體積的確定。精密吸取沒(méi)食子酸0.2 mL 7份分別置于25 mL容量瓶中，其中6瓶分別加入2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL的10 % Na2CO3溶液和2.0mL的FC試劑，蒸餾水定容，搖勻，在室溫下顯色40 min，以相應(yīng)溶液為空白試劑，在765 nm處測(cè)定吸光度。

(3)顯色時(shí)間的確定

精密吸取沒(méi)食子酸0.2 mL置于25 mL容量瓶中，加入2.0 mL的FC試劑和4.0 mL的10 % Na2CO3溶液，用蒸餾水定容，以不加入沒(méi)食子酸的為空白試劑，在室溫下顯色不同時(shí)間，分別在765 nm處測(cè)吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

表3　沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍實(shí)驗(yàn)結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為Y=141.14X-0.0103，R2= 0.9997，沒(méi)食子酸在0.00051～0.00565 g/L與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2FC試劑體積的確定

圖1　FC試劑加入量對(duì)總酚含量測(cè)定的影響

由圖1可知，F(xiàn)C試劑的加入量會(huì)影響總酚的測(cè)定值，吸光度的值先減小然后再增大，當(dāng)加入量為2.5 mL時(shí)，測(cè)得吸光度為最大，繼續(xù)加入FC試劑時(shí)吸光度減小，因此FC試劑顯色劑的最佳加入量為2.5 mL。

2.3Na2CO3體積的確定

由圖2可知，10 % Na2CO3緩沖溶液加入量影響總酚的測(cè)定值。隨著加入量的增大，吸光度隨著增大，當(dāng)10 %Na2CO3加入量達(dá)到5 mL時(shí)，吸光度達(dá)到最大值。此后加入10 % Na2CO3后吸光度逐漸減小，并趨于穩(wěn)定。因此10 % Na2CO3的加入量最佳值為5.0 mL。

圖2　Na2CO3體積對(duì)多酚含量的影響

2.4顯色時(shí)間的確定

精密吸取沒(méi)食子酸溶液0.2 mL 5份分別置于25 mL容量瓶中，分別加入2 mL FC試劑和4.0 mL Na2CO3，蒸餾水定容，相應(yīng)溶液做空白對(duì)照，在室溫下顯色不同時(shí)間后，在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。

圖3　總酚含量隨顯色時(shí)間的變化

由圖3可知，顯色時(shí)間影響總酚的測(cè)定值，當(dāng)顯色80 min時(shí)，吸光度最大，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而無(wú)明顯變化。

2.5各實(shí)驗(yàn)測(cè)定

精密吸取0.00、0.05 mL、0.15 mL、0.25 mL、0.35 mL、0.45 mL、0.55 mL對(duì)照品溶液置于25 mL容量瓶中，分別加入2.5 mL的FC試劑、5 mL 10 % Na2CO3溶液，用蒸餾水定容，搖勻，室溫下顯色80 min，以第1瓶為空白試劑，在波長(zhǎng)為765 nm處分別測(cè)定吸光度[7]。

2.5.1精密度實(shí)驗(yàn)[7]

精密吸取同一供試品溶液0.0 mL、5份0.8 mL分別置于25 mL容量瓶中，分別加入2.5 mL的FC試劑、4.0 mL 的10 % Na2CO3溶液，蒸餾水定容至刻度，搖勻，室溫下顯色80 min，以第1瓶為空白試劑，在765 nm處平行測(cè)定吸光度，分別為0.156、0.159、0.155、0.156、0.155，RSD= 2.13 %。

2.5.2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)[7]

精密吸取0.0、0.8 mL供試品溶液至25 mL容量瓶中，分別加入2.5 mL的FC試劑和4.0 mL的10 % Na2CO3溶液，蒸餾水定容至刻度，搖勻，室溫下顯色80 min，以第1瓶為空白試劑，在765 nm處每隔10 min測(cè)定1次吸光度，測(cè)定5次。吸光度分別為0.160、0.157、0.156、0.156、0.154，可以看出在顯色80 min后的40 min內(nèi)吸光度值基本保持不變，穩(wěn)定性良好。

2.5.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批的酒曲5份，每份約2 g，置于100 mL容量瓶中，加入30 mL無(wú)水乙醇，加熱回流10 h，抽濾，抽濾后減壓濃縮成浸膏，用無(wú)水乙醇定容至100 mL，作為供試品。精密吸取0.8 mL供試品溶液，置于25 mL容量瓶中，分別加入2.5 mL的FC試劑和4.0 mL的10 % Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，室溫下顯色80 min，以不加供試品的相應(yīng)溶液為空白試劑，在765 nm處測(cè)定吸光度，分別為0.156，0.156，0.159，0.155，0.155。吸光度平均值為0.156，多酚平均含量為1.841 mg/g，RSD=7.8 %。

2.5.4加樣回收實(shí)驗(yàn)[7]

稱取同一批酒曲5份，每份約1.000 g，按照上述操作制備5份供試品，從中吸取0.8 mL置于5個(gè)25 mL容量瓶中，再分別加入0.8 mL對(duì)照品溶液，2.5 mL的FC試劑，5 mL10 % Na2CO3溶液，蒸餾水定容，搖勻，相應(yīng)溶液做空白，在室溫下顯色80 min后測(cè)定其吸光度。以不加供試品和對(duì)照品的相應(yīng)溶液作為空白試劑，測(cè)量其吸光度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　多酚加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分別以槲皮素和沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，用Na-NO2-Al(NO3)3-NaOH為顯色劑，采用紫外分光光度法測(cè)定茅臺(tái)鎮(zhèn)酒曲總黃酮含量，利用福林比色法測(cè)定多酚含量，結(jié)果表明，茅臺(tái)醬香型酒曲中黃酮含量為9.695 mg/g，多酚含量為1.841 mg/g。該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為測(cè)定醬香型酒曲黃酮和總酚含量的檢測(cè)方法。

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Determination of Total Flavonoids and Total Polyphenols Content in Jiangxiang Daqu

WANG Xingdong1,2, MU Mingyue3, YANG Yupu2, YANG Chengyue2, LI Mengjie2, ZHANG Qianjun2, ZHOU Qingdi4and WEI Gang5
(1.Fine Chemical Engineering Research Center, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025; 2. School of Chemistry and Chemical Engineering，Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025; 3. Maotai Distillery Co.Ltd., Renhuai, Guizhou 564501; 4. College of Chemistry, Sydney University, Sydney 1797,Australia; 5.CSIRO Materials Science and Engineering, Lindfield, NSW 2070,Australia)

Abstract:The method for the determination of total flavonoids and polyphenols content in Jiangxiang Daqu had been developed as follows: total flavonoids content determined by visible spectrophotometry (quercetin as the reference substance) and total polyphenols content determined by Folin-Ciocateau colorimetry (gallicacid as the reference substance). The method had a good linearity in the range of 0.0210～0.1050 g/L of quercetin (r=0.9976) and 0.00051～0.00565 g/L of gallicacid.(r=0.9997). The results showed that the content of total flavonoids and polyphenols in Jiangxiang Daqu were 9.70 mg/g and 1.84 mg/g respectively. Such method was simple to operate with good accuracy and reproducibility and it was suitable for quantitative determination of flavonoids or polyphenols in Jiangxiang Daqu.

Key words:Jiangxiang Daqu; flavonoids; polyphenols; spectrophotometry; Folin-Ciocateau colorimetry

通訊作者：張前軍，女，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)，E-mail：qianjunzhang@126.com；衛(wèi)鋼，男，博士，教授，研究方向：有機(jī)材料，E-mail：gangwei@csiro.au。

作者簡(jiǎn)介：王興東(1987-)，男，在讀碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。

收稿日期：2015-09-10；修回日期：2015-11-09

基金項(xiàng)目：教育部“春暉計(jì)劃”項(xiàng)目（Z2015003）。

DOI：10.13746/j.njkj.2015372

中圖分類(lèi)號(hào)：TS261.1；TS62.3；TS261.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）03-0115-04

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2015-12-30；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20151230.0950.009.html。