蟲草菌粉對急性百草枯中毒大鼠肺損傷的治療及相關機制

張詩昊　丁青青

【摘 要】 目的：觀察蟲草菌粉對急性百草枯中毒大鼠肺損傷的治療作用及相關機制。方法：選用健康成年SD大鼠112只（雌雄各半），隨機分為A、B、C、D組。A組（健康對照組）7只，B組（單純染毒組）35只，C組（蟲草菌粉治療組）35只，D組（蟲草菌粉對照組）35只。B、C組給予一次PQ 20mg/Kg腹腔注射，A、D組給予一次等量生理鹽水腹腔注射。C、D組每日給予蟲草菌粉5g/kg灌胃。觀察4組大鼠狀況、病理學變化與相關指標水平變化。結果：A、C、D組大鼠各時間點精神狀態、活動度均表現良好，呼吸平穩；C組與A、D組比較。大鼠狀況與病理學變化明顯，各指標水平差異均有統計學意義（P<0.05）；經蟲草菌粉灌胃，C組與B組比較癥狀明顯改善；且C組大鼠肺組織損傷程度、血清中MDA、SOD、GSH-Px水平，C組肺濕/干重比值（W/D）、肺損傷肺組織中α1-AT水平均顯著優于B組（P<0.05）。結論：蟲草菌粉對PQ中毒引起的急性肺損傷有較好的治療作用，可清除氧自由基，提高機體抗氧化損傷、抑制脂質過氧化，可促進α1-AT表達，減輕PQ中毒引起的肺組織損傷。

【關鍵詞】 百草枯中毒；蟲草菌粉；肺損傷

【中圖分類號】R595.4 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）05-0081-03

百草枯（PQ）有著良好的除草效果，且使用范圍廣泛，但中毒死亡率極高，對醫療工作者提出了巨大的挑戰。PQ中毒致死量小，肺組織中毒物濃度最高，因此肺損傷最為嚴重，患者多死于呼吸窘迫綜合征，死亡率可高達85%～95%[1]。目前治療百草枯中毒的中成藥還比較少。蟲草菌粉是從新鮮冬蟲夏草中分離得到菌絲體，經發酵培養所得菌絲體的干燥粉末，開展蟲草菌粉對急性百草枯中毒大鼠肺損傷研究可為開拓臨床應用范圍和指導臨床實踐、增加適應癥，提供實驗依據和理論基礎[2]。實驗通過復制PQ急性中毒大鼠模型，觀察蟲草菌粉對PQ中毒所致急性肺損傷的治療作用及機制，以便采取中西醫結合以及其他綜合治療措施，延長患者壽命。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 健康成年SD大鼠112只（雌雄各半），體質量250～300g，由贛南醫學院實驗動物中心提供。20%百枯草原液（先正達（中國）投資有限公司）；蟲草菌粉（批號：040801，江西金水寶制藥有限公司）。MDA試劑盒（批號：20101022）、SOD試劑盒（批號：20101025），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（批號：20101025）均購自南京建成生物工程研究所。α1-抗胰蛋白酶（α1-AT）蛋白抗體、免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 分組及給藥 選用健康成年SD大鼠112只，隨機分為A、B、C、D組。A組：健康對照組7只；B組：單純染毒組35只；C組：蟲草菌粉治療組35只；D組：蟲草菌粉對照組35只。B、C組給予一次PQ20mg/Kg腹腔注射，A、D組給予一次等量生理鹽水腹腔注射。C、D組每日給予蟲草菌粉5g/kg灌胃，A、B組每日給予等量生理鹽水灌胃。

1.3 標本采集與檢測 B組、C組分別于染毒后1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d各取5只大鼠心臟取血處死，留取血標本，測定丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）。A組、D組也在相同時間點測定以上指標，測定方法按試劑盒說明進行。同時，以上各組均取大鼠整個左肺，用濾紙吸干血漬，分析天平稱重后放入80℃恒溫烤箱烘烤24h，計算肺濕/干重比值（W/D），右肺前葉組織制備病理切片，進行蘇木精-伊紅染色（HE），在400倍光鏡下進行病理觀察。應用免疫組化法，PQ中毒急性肺損傷肺組織中α1-抗胰蛋白酶（α1-AT）的表達（肺組織石蠟切片免疫組織化學方法檢測α1-AT蛋白表達，按試劑盒說明書操作）。采樣方法：心臟取血處死大鼠，采血收集血樣并取出左、右肺，采血注射器及試管均在實驗前用500u/ml肝素濕潤。α1-AT免疫組化染色陽性切片與40HP物鏡下挑選10個視野觀測陽性細胞胞漿平均吸光度（OD），以其單位面積相對含量反應染色強度。

1.4 統計分析 采用SPSS17.0統計軟件進行數據的處理分析，計量資料均采用均數加減標準差（x±s）表示，組間均數比較采用單因素方差分析，組內比較采用LSD最小顯著差法，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般狀況 A組與D組大鼠精神狀態良好，活動如常，能夠自由進食飲水。B組大鼠在腹腔注射PQ 2h開始出現精神差，萎靡不振，伴有不同程度的毛發松散、瞇眼、步態蹣跚與拱背。1d后出現四肢末端、口唇紫紺，呼吸加快加深，并隨著時間的延長而加重；3～7d后出現觸之反應差，靜伏，呼吸急促或點頭樣呼吸，甚至呼吸窘迫情況，全身出現明顯紫紺；14d后存活的大鼠癥狀開始逐漸減輕，并恢復正常；21d后存活大鼠再次出現呼吸頻率加快、氣促，個別大鼠死亡前出現呼吸困難、紫紺等缺氧癥狀，其余無明顯紫紺。C組與B組比較，大鼠各時間點精神狀態、活動度均表現良好，呼吸平穩，癥狀明顯改善。

2.2 大鼠肺組織病理學變化 A組與D組大鼠肺組織結構完整，肺臟表面呈粉紅色，質軟富有彈性，表面光滑。B組大鼠1d肺泡結構清晰，肺泡腔可見少量炎性細胞滲出，表面僅見散在點狀出血；3d肺泡結構可辨認，肺泡壁局部增厚，肺泡腔大量炎性細胞滲出；7d肺組織中表現出巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞浸潤，部分肺泡腔有透明膜形成，充滿水腫液，肺泡壁斷裂，嚴重的有彌漫性肺出血，甚至結構消失，隨著時間的延長，肺組織損傷程度逐漸加重；14d出現部分肺泡間隔纖維性增厚，肺泡結構不清，肺泡腔內充滿炎性細胞滲出，但較之前減少，可見膠原纖維增生；21d大部分肺泡明顯塌陷，形成纖維細胞進一步增多；28d肺明顯形成纖維化，肺泡腔、肺間質內炎性細胞浸潤，且生成大量纖維細胞；35d大鼠肺纖維化病灶數明顯增多。蟲草菌粉干預的C組大鼠肺組織損傷比B組顯著更輕。

2.3 血清中MDA、SOD、GSH-Px測定比較 各時間點四組大鼠血清中MDA、SOD、GSH-Px水平見表1-3。

2.4 大鼠肺濕/干重比值（W/D）、肺損傷肺組織中α1-AT水平 A組W/D值：（2.44±0.16），B組W/D值：（5.05±1.31），C組W/D值：（3.87±1.00），D組W/D值：（2.68±0.13）。B組與C組W/D值均顯著與A組與D組（P<0.01），且C組W/D值顯著低于B組（P<0.01）。

2.5 四組大鼠肺損傷組織中α1-AT水平對比 對比觀察四組大鼠肺損傷組織中α1-AT水平。見表4。

3 討論

PQ是一種高效能的非選擇性接觸型除草劑，對人畜具有很強毒性，贛南地區百草枯在農村應用廣泛，臨床工作中PQ中毒患者屢見不鮮。肺是主要靶器官，PQ中毒可導致“PQ肺”，早期表現為急性肺損傷（ALI）或急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），后期出現肺泡內和肺間質纖維化，是PQ中毒致死的主要原因，其中單純因肺部損傷死亡所占的比例達50%～70%[3]。研究發現，大鼠在腹腔注射PQ 2h開始出現精神差，萎靡不振，伴有不同程度的毛發松散、瞇眼、步態蹣跚與拱背。1d后出現四肢末端、口唇紫紺，呼吸加快加深，并隨著時間的延長而加重；3d后出現觸之反應差，靜伏，呼吸急促，甚至呼吸窘迫情況；7d與14d，表現為為急性肺損傷；21～35d大鼠急性損傷基本緩解，同時現肺纖維化。C組與B組比較，大鼠各時間點精神狀態、活動度均表現良好，呼吸平穩，癥狀明顯改善；而經組織病理觀察，大鼠PQ中毒后肺組織中表現出巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞浸潤，部分肺泡腔有透明膜形成，充滿水腫液，肺泡壁斷裂，嚴重的有彌漫性肺出血，甚至結構消失，隨著時間的延長，肺組織損傷程度逐漸加重。

PQ中毒所致的急性肺損傷目前無特效解毒藥物，研究主要在氧自由基損傷方面展開，抗氧化劑維生素C、維生素E、色甘酸鈉、還原型谷胱甘肽都曾經用于治療PQ中毒急性肺損傷[4]，但效果都不確切。研究表明[5]，蟲草菌粉在肺組織炎性及纖維化疾病中有一定的治療作用。超氧化物歧化酶（SOD）與谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）廣泛存在于需氧物體，均為構成肺內抗脂質過氧化酶性保護系統的主要酶，是體內最重要的自由基清除劑，其活性間接反映了機體清除自由基的能力。丙二醛（MDA）是機體內氧自由基代謝過程中產生的脂質過氧化產物，反映了機體脂質過氧化自由基的存在與過氧化反應的程度[4]。PQ進入體內后，經自由基損傷作用造成肺組織氧化性損傷，因此對SOD、GSH-Px活性、MDA濃度的變化進行監測能夠反映機體清除自由基、抗脂質過氧化損傷的能力[4-5]。研究結果表明，PQ中毒大鼠血清的SOD、GSH-Px活性顯著下降，MDA濃度顯著升高，該改變可能與PQ在體內代謝中生成活性氧自由基過程有關，在PQ進入體內后先產生氧離子，在SOD的作用下形成H2O2，中毒早期血漿中SOD活力顯著下降，而中毒中晚期SOD活力稍有升高。GSH-Px活性隨著時間的延長呈顯著下降，可能與PQ中毒后期H2O2較多有關[6]，迅速形成的大量的OH-將大量消耗GSH-Px。給予PQ中毒大鼠以蟲草菌粉治療，血清中MDA含量明顯下降，而SOD活性明顯升高，結果提示蟲草菌粉可通過清除氧自由基，提高機體抗氧化損傷、抑制脂質過氧化，達到PQ對肺組織損傷的作用。另外，研究發現，在急性肺損傷模型中，內毒素組α1-AT 活性明顯低于對照組，可能因急性肺損傷造成彈性蛋白酶、胰蛋白酶大量釋放，造成蛋白酶與抑制劑比例失衡，ARDS患者注射α1-AT抑制彈性蛋白酶的活性，可減輕內毒素引起的肺組織損傷[6]。本研究結果表明，百草枯中毒大鼠血清肺組織中α1-AT水平在中毒7d后顯著下降，而采用蟲草菌粉可促進α1-AT表達，減輕PQ中毒引起的肺組織損傷。

綜上所述，蟲草菌粉在PQ急性中毒中有較好的治療作用，治療作用與減輕自由基損傷，促進α1-AT表達有關。

參考文獻

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（收稿日期：2015.12.25）