痤瘡顆粒微生物限度檢查方法的建立

熊雯，程龍，鄭萍

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痤瘡顆粒微生物限度檢查方法的建立

熊雯，程龍，鄭萍

[摘要]目的：建立痤瘡顆粒的微生物限度檢查方法。方法：按照《中國藥典》2010年版的規定，采用常規法進行微生物限度檢查方法驗證。結果：痤瘡顆粒對細菌的抑制作用較小，常規法驗證對五種試驗菌的回收率均高于70％。結論：用該法進行微生物限度檢查，可以客觀地反映藥物中微生物的污染狀況，以達到檢測目的。

[關鍵詞]痤瘡顆粒；微生物限度檢查；方法驗證

[作者單位]成都市食品藥品檢驗研究院，四川成都610041

痤瘡顆粒是以琵琶葉、桑白皮、生地、丹皮、赤芍等為主要成分的口服給藥制劑?？紤]到中藥成分對細菌、霉菌和酵母菌可能存在一定的抑制作用[1～4]，常規檢查方法不能真實地反映藥品中微生物污染的情況，故應按照《中國藥典》2010年版的要求[5]，對所采用的檢查方法進行驗證，以確認抑菌活性的消除和檢查方法的有效性。

1　材料

1.1儀器

超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）SW-CJ-2FD；生物安全柜（蘇凈集團安泰公司）BHC-1000ⅡA/ B3；生化培養箱（上海一恒科技有限公司）LRH-250；隔水式恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）GHP-9270；微生物限度檢驗儀（杭州盈天科學儀器有限公司）YT-X300

1.2菌種

大腸埃希菌[CMCC(B) 44102]，金黃色葡萄球菌[CMCC(B) 26003]，枯草芽孢桿菌[CMCC(B) 63501]，白色念珠菌[CMCC(F) 98001]，黑曲霉[CMCC(F) 98003]，銅綠假單胞菌[CMCC(B) 10104]，均為第4代，來源于中國藥品生物制品檢定所。

1.3培養基及試劑

營養肉湯培養基、營養瓊脂培養基、改良馬丁培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖培養基、MUG培養基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基、沙氏葡萄糖液體培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養基，均由北京三藥科技開發公司生產。

pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，0.9％無菌氯化鈉溶液，0.1％蛋白胨水溶液均由北京三藥科技開發公司生產，聚山梨酯80由天津市美琳工貿有限公司生產。

1.4樣品

痤瘡顆粒（批號：131101；131201；140201）

2　方法與結果

2.1細菌數計數方法的驗證

2.1.1常規法測定細菌數的方法驗證

①菌液制備 取經35℃培養22 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的營養肉湯培養物，用0.9％無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至約含50～100 CFU．mL-1的菌懸液，做活菌計數備用；

②供試液制備 取本品10 g，加pH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 mL，45℃水浴，混勻得1:10供試液。

③回收率測定

供試品對照組 取1:10供試液1 mL，平行制備2個平板，測定供試品本底細菌數；

菌液組 分別取上述3種試驗菌懸液1 mL，注入平皿，每株試驗菌平行制備2個平皿，傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養，測定所加的試驗菌數。

試驗組 取1:10供試液1 mL和大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌試驗菌懸液1 mL，分別注入平皿中，傾注營養瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平板，待凝固后，35℃培養3天，計數；

④結果：三次獨立的平行試驗結果如下表所示

試驗組菌回收率：(試驗組菌數-供試品對照組菌數)/菌液組菌數×100％。

表1　常規法（1 mL/皿）驗證細菌計數試驗結果（CFU/皿）

表2　常規法（1 mL/皿）驗證細菌計數試驗結果（cfu/皿）

表3　常規法（1 mL/皿）驗證細菌計數試驗結果（cfu/皿）

綜合表1、2、3可以看出，本品采用常規法（1 mL/皿）檢查細菌數，在三次獨立的平行試驗中，供試品對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的人工染菌回收率均高于70％，因此，本品細菌計數可采用常規法（1 mL/皿）。

2.2霉菌和酵母菌數計數方法的驗證

2.2.1常規法測定霉菌和酵母菌數的方法驗證

①菌液制備 取經25℃培養24 h的白色念珠菌改良馬丁培養基培養物，用0.9％無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至約含50～100 CFU．mL-1的菌懸液，做活菌計數備用；

取經25℃培養7 d的黑曲霉菌改良馬丁瓊脂培養基斜面培養物，加5 mL含0.05％聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸出孢子懸液（用管口帶有薄的紗布的無菌毛細吸管吸出胞子懸液）至無菌試管中，用含0.05％聚山梨酯80的0.9％無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至約含50～100 CFU．mL-1的孢子懸液，做活菌計數備用。

②供試液制備 取本品10 g，加pH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 mL，45℃水浴，混勻得1:10供試液。

③回收率測定

供試品對照組 取1:10供試液1 mL，平行制備2個平板，測定供試品本底霉菌和酵母菌數。

菌液組 分別取上述2種試驗菌懸液1 mL，注入平皿，每株試驗菌平行制備2個平皿，傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度培養，測定所加的試驗菌數。

試驗組 取1:10供試液1 mL和白色念珠菌、黑曲霉菌懸液1ml傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平板，待凝固后，25℃培養5天，計數。

結果 試驗組菌回收率：(試驗組菌數-供試品對照組菌數)/菌液組菌數×100％。

表4　常規法驗證霉菌和酵母菌計數試驗結果（cfu/皿）

從表4可以看出，本品采用常規法檢查霉菌和酵母菌數，在三次獨立的平行試驗中，供試品對白色念珠菌和黑曲霉的人工染菌回收率均高于70％，因此，本品霉菌和酵母菌計數可采用常規法（1 mL/皿）。

2.3控制菌檢查方法的驗證

2.3.1大腸埃希菌檢查方法的驗證

①供試液制備 取本品10 g，加pH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 mL，45℃水浴，混勻得1:10供試液。

②菌液制備 取經35℃培養22 h的大腸埃希菌的營養肉湯培養物，用0.9％無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至約含50～100 CFU．mL-1的菌懸液，做活菌計數備用；③常規法檢查大腸埃希菌

試驗組 取1:10供試液10 mL及制備好的大腸埃希菌懸液1 mL加入到100 mL的膽鹽乳糖培養基中，35℃培養22 h。吸取0.2 mL培養物接種至5 mL MUG培養基中，35℃培養，于5 h、24 h在366 nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養基作本底對照。觀察后，沿培養管的管壁加入數滴靛基質試液，觀察顏色變化。

陽性對照組 取制備好的大腸埃希菌菌懸液1 mL加入到100 mL的膽鹽乳糖培養基中培養，其他操作同試驗組。

供試品對照組 取1:10供試液10 mL加入到100 mL膽鹽乳糖培養基中，其他操作同試驗組。

陰性對照組 取10 mL pH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液加入到100 mL膽鹽乳糖培養基中，其他操作同試驗組。

2.3.2結果

表5　大腸埃希菌檢查方法（膽鹽乳糖培養基：100 mL）驗證結果

由表5可知，陰性對照組和供試品對照組中，紫外燈下觀察和靛基質反應均呈陰性，而試驗組加入大腸埃希菌培養后，366 nm紫外下呈現熒光，且加入靛基質后，液面呈玫瑰紅色，都和陽性對照組一樣。因此，本品大腸埃希菌可采用常規法（膽鹽乳糖培養機100 mL）進行檢查。

3　討論

本品可采用常規法進行細菌計數、霉菌和酵母菌計數以及控制菌的檢查。根據驗證結果將微生物限度檢查方法記錄如下：取本品10 g，加pH7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 mL，45℃水浴，搖勻得1:10供試液。細菌計數、霉菌和酵母菌計數以及控制菌均采用常規法進行檢查，所建立方法可有效地控制痤瘡顆粒的微生物限度。

[參考文獻]

[1]陳佳佳,廖森泰,孫遠明,等.中草藥抑菌活性成分研究進展[J].中藥材,2011,34(8):1313.

[2]楊淑文.32種中草藥抑菌活性的比較研究[J].安徽農業科學,2011,39(3):1361.

[3]蘇德模,馬緒榮.藥品微生物學檢驗技術[M].北京:華齡出版社: 221．

[4]潘雯,關倩明,林玲.7種具有抑菌成分中成藥的微生物限度檢查方法驗證[J].廣東藥學院學報, 2012, 28(6):623.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[s].北京:中國醫藥科技出版社,2010:附錄 ⅪJ108.

（責任編輯：陳思敏）

Validation of microbial limit test method of Cuochuang Keli

XIONG Wen, CHENG Long, ZHEN Pin
(ChengDu Institutes for Food and Drug Control, Chengdu, 610041, China )

[Abstract]Objective: To establish a method for the microbial limit test of Cuochuang Keli.Method: According to the Chinese Pharmacopoeia 2010 edition, the routine method was performed for microbial limit test validation of Cuochuang Kei.Result: Cuochuang Keli hardly had the antimicrobial activity.The routine method was feasible for microbial limit test.Conclusion: This method applied for microbial limit test can objectively reflect the status of microbial contamination in drugs so as to meet the destination of examination.

[Key words]Cuochuang Keli; microbial limit test; validation

[收稿日期]2015-03-17

[通訊作者]鄭萍(1969-), 女, 主任藥師, 主要從事藥品質量控制研究 Email: zhengping028@foxmail.com

[作者簡介]熊雯(1978-)，女，碩士研究生，副主任藥師，主要從事藥品質量控制研究Tel:028-85362197 Email:xiongwen613@163.com

[中圖分類號]R 283.3

[文獻標識碼]A

[文章編號]1674-926X(2016)01-012-03