活性維生素D3聯合LY294002體外抑制大鼠肝星狀細胞增殖作用研究*

王蕾，李校天，張利，張九娜

·實驗性肝炎·

活性維生素D3聯合LY294002體外抑制大鼠肝星狀細胞增殖作用研究*

王蕾，李校天，張利，張九娜

目的探究維生素D的活性形式—1，25-(OH）2D3聯合磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt）信號通路的特異抑制劑LY294002對體外培養大鼠肝星狀細胞的抑制作用。方法將HSC-T6細胞分為正常對照、DMSO組、1,25-(OH）2D3、LY294002組和1,25-(OH）2D3+ LY294002 聯合組，采用MTT法檢測細胞增殖；在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化；使用流式細胞術檢測HSC-T6細胞凋亡；采用Western blotting法檢測Phospho-Akt（Ser473）、AKT（PAN）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3蛋白表達。結果體外干預肝星狀細胞48 h后，兩藥聯合干預組細胞抑制率為87.5%，顯著高于1，25-（OH）2D3組的50.3%或LY294002組的40.3%（P＜0.05）；聯合組細胞凋亡率為92.12%，顯著高于1，25-(OH）2D3組的71.0%或LY294002組的34.0%（P＜0.05）；在顯微鏡下觀察，兩藥處理組細胞形狀由星形變為不規則形,凋亡數量增多,表現為正常活細胞數目明顯減少,胞間隙增寬,細胞體積縮小,胞漿濃縮,胞核固縮,可見空泡及細胞碎片，有的細胞出現數量不等的凋亡小體；與單藥干預組比，聯合組細胞Bax/Bcl-2比值上升明顯（P＜0.05），活化的凋亡蛋白caspase-3表達顯著增加（P＜0.05）。結論1，25-（OH）2D3可協同LY294002 共同誘導HSC-T6 細胞凋亡，增強其抗肝纖維化的效果。

大鼠星狀細胞；細胞凋亡；LY294002；1，25-（OH）2D3；磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶

磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B （PI3K/Akt）信號轉導通路普遍存在于各類細胞中，在細胞存活與分化、生長、運動和凋亡等多種生理及病理過程中起重要作用[1,2]，參與腫瘤、神經系統疾病以及自身免疫性疾病等多種疾病的發生發展[3～5]。也有研究發現，PI3K/Akt信號通路在肝臟細胞外基質（ECM）的產生和降解中起到重要作用，證實該通路參與調控肝纖維化過程[6,7]。作為第一個化學合成的小分子抑制劑，LY294002可與PI3K家族成員形成可逆性結合，從而特異性阻斷PI3K/Akt信號通路，促進多種細胞凋亡，但其針對肝纖維化的作用研究較少。1,25-二羥基維生素D3（1,25-(OH）2D3）作為維生素D的生物活性形式可發揮類固醇激素樣作用，調控上百種不同基因的表達, 在許多正常或異常細胞的增殖、分化和凋亡過程中扮演著重要角色[8]。有體內外研究發現活性維生素D參與了肝纖維化的發生發展，并通過不同的作用機制表現出一定的抗纖維化作用[9～11]，但其具體作用機理尚未完全明確。有學者通過聯合應用LY294002和1,25-(OH）2D3發現它們可明顯提高腎系膜細胞的凋亡率，從而達到抗腎臟纖維化的效果[12]，但兩者聯合應用后對肝星狀細胞生長的影響尚未見報道。為此，本實驗研究了PI3K/Akt信號通路抑制劑（LY294002）聯合1,25-(OH）2D3對大鼠肝星狀細胞增殖抑制的影響，并進一步探討其作用機制，為應用其抗肝纖維化的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥品、試劑與儀器大鼠肝星狀細胞(Hepatic stellate cell, HSC-T6）由河北省消化疾病研究所提供。1,25-(OH）2D3、DMSO、四甲基偶氮唑藍（MTT）均為美國Sigma公司生產；LY294002、蛋白裂解液購自南京碧云天公司；兔抗人Phospho-Akt(Ser473）、AKT(PAN）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(H+L）、抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3多克隆抗體、抗GAPDH、AnnexinV-PI凋亡試劑盒均購自美國Biovision公司；小牛血清、DMEM 培養基均購自美國Hyclone公司；其余試劑均為國產分析純。主要儀器: 恒溫CO2培養箱產自美國Thermo Forma 公司，超凈工作臺產自蘇州安泰公司，倒置顯微鏡、熒光顯微鏡均產自日本Olympus 公司,流式細胞儀產自美國Beton Dickinson公司。

1.2 細胞培養及分組取HSC-T6細胞，以2×105/ ml接種到含10%小牛血清的高糖DMEM培養基中，約6～8 h貼壁,每24～48 h換液，過3～4 d，當細胞增殖達到80%～90% 融合成片的單層細胞時，棄去培養基，以無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，以含0.25%胰酶的消化液消化，將處于對數生長期的細胞按1：3或1：4 傳代接種。將細胞分為以下5組：①正常對照(N）組，以含10%FBS的DMEM培養基培養；②DMSO(D）組，含10%FBS的DMEM以及終濃度為0.1% DMSO；③1,25-(OH）2D3(C）組，終濃度分別為2.5×10-8mol/L、2.5×10-7mol/L、2.5 ×10-6mol/L; ④LY294002（LY）組，5×10-6mol/L;⑤1,25-(OH）2D3+LY294002 (C+LY）組，2.5×10-8mol/L、2.5×10-7mol/L、2.5×10-6mol/L的1,25-(OH）2D3+5×10-6mol/L LY294002 。根據我們前期工作和相關文獻報道確定各組加藥濃度[11,13]，在含5% CO2的37℃恒溫培養箱中培養48 h。

1.3細胞增殖抑制率測定采用MTT 法，收集處于對數生長期的HSC-T6細胞，調整細胞密度約為5×103/孔，接種于96 孔板，將僅含培養基的任一孔作為空白對照，培養細胞過夜，待貼壁后按上述各分組及藥物濃度進行干預。在含5% CO2的37℃恒溫培養箱中繼續培養48 h，終止實驗。每組各設6個復孔，每孔加入0.5 g/L MTT 20μl( 5 g/L），暗處反應4 h，吸出孔內剩余培養液，再于每孔加入DMSO150μl，充分混勻約10 min。使用酶標儀于波長492 nm 處，測定各孔吸光度( A）值，并按公式計算兩種藥物干預對各組細胞增殖抑制率，即抑制率(%）=｛1-(實驗組A值-試劑對照組A值）/(細胞對照組A值-空白對照組A值）｝×100%

1.4細胞形態學觀察將對數生長期的細胞按所需濃度接種,待細胞完全貼壁后加藥處理, 分組同1.2，孵育培養48 h后，于倒置顯微鏡下觀察細胞變化，并隨機拍照。

1.5細胞凋亡率檢測用含0.25%胰酶的消化液消化并收集各組經48 h干預培養的細胞，細胞約為2.5×105/ml，移至離心管，1000 r/m離心5 min，棄上清液，用PBS洗滌3次，吸取細胞懸液100 μL至1.5 mL EP管中。按照Annexin V-FITC-PI試劑盒說明書進行操作，每管加入PI 5 μL、熒光素標記的Annexin V-FITC 5 μl，混勻，室溫下避光孵育15 min，加入Binding Buffer 500 μL，上流式細胞儀，檢測細胞凋亡率，重復檢測3次，結果取平均值。

1.6 凋亡相關蛋白表達檢測采用Western blotting法，收集1×107個細胞，應用RIPA裂解液提取細胞蛋白，用BCA法計算樣品蛋白濃度。取蛋白40 μg，按分組順序依次上樣,應用不連續SDS-PAGE法進行蛋白電泳，將分離后的蛋白質轉至PVDF膜上，靜置2.5 h，按照0.1 ml/cm2膜加入相應濃度一抗(1:1000）封口，于4℃冰箱孵育過夜，洗膜后再以二抗（1:2000）封閉，并在暗室中用化學發光法（ECL）曝光膠片,沖洗顯色后，采集顯影條圖像，應用Image-Pro Plus 6.0軟件進行灰度定量分析，以GAPDH作為內參，計算目的條帶與內參條帶的灰度比值，并作為最終結果。

1.7 統計學處理應用SPSS 17.0統計軟件進行實驗數據分析，所有數據均為3次獨立實驗結果的平均值。計量資料以(±s）表示, 組間差異采用單因素One way-ANOVA方差分析，計數資料用“率”表示,采用x2檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物對大鼠肝星狀細胞增殖抑制率的影響如表1所示，經過不同藥物干預處理的T6細胞48 h后，與正常對照組比較，細胞生長受到明顯抑制。當與LY294002聯用時，細胞的存活率(%）隨1，25-(OH）2D3濃度的增加而降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，說明1，25-(OH）2D3與LY294002聯用的細胞毒作用大于單獨用藥組。

表1 各組細胞（n=5）增殖抑制率比較

2.2細胞形態學變化在倒置相差顯微鏡下觀察，發現與空白對照組比,各干預組細胞出現不同程度的形態改變。當LY294002(5×10-5mol/L）聯合最大濃度（2.5×10-6mol/L）的1，25-(OH）2D3作用于T6細胞48h后,細胞密度降低，并出現典型的凋亡形態。與LY294002組和1，25-(OH）2D3單獨作用組比，細胞形態改變較明顯，可見細胞形狀由星形變為不規則形,凋亡數量增多,表現為正常活細胞數目明顯減少,胞間隙增寬,細胞體積縮小,胞漿濃縮,胞核固縮,可見空泡及細胞碎片，有的細胞出現數量不等的凋亡小體（圖1）。

圖1 各組細胞形態學變化（200×）A：空白對照組；B:1,25-（OH）2D3組；C:LY294002組；D:聯合組

2.3 各組T6細胞凋亡率比較按照實驗分組處理HSC-T6細胞48 h后，1，25-（OH）2D3和LY294002組細胞凋亡率較前增高顯著，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；兩藥聯用較單獨應用LY294002組細胞凋亡率明顯增高，說明1，25-（OH）2D3與LY294002共用可協同誘導HSC-T6細胞凋亡（表2）。

表2各組HSC-T6細胞凋亡率比較

2.4 各組HSC-T6細胞凋亡相關蛋白表達的變化經Western blotting法檢測，經1，25-(OH）2D3和LY294002干預48 h后，與空白對照組比，HSC-T6細胞磷酸化的Ser473和磷酸化的Akt蛋白表達均出現不同程度的降低，聯合用藥組降低最明顯，但各組總Akt 和Ser473蛋白水平則無明顯變化，提示兩藥聯合作用強有力地抑制了Akt在Ser473位點的磷酸化，而沒有影響到總Akt蛋白的表達。兩者聯合應用可能通過下調PI3K/Akt信號通路達到對HSC的抑制增殖和誘導凋亡作用。同時，為了解兩種藥物導致HSC凋亡是否與凋亡調節蛋白的表達有關，我們進一步應用Western blotting法測定了Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達情況，結果發現各干預組促凋亡蛋白Bax條帶與空白對照組比較，表現出不同程度的上調，以聯合用藥組為著，而抗凋亡蛋白Bc1-2與對照組比較則出現降低趨勢，聯合用藥組降低最明顯，Bax/Bcl-2比值上升。兩者聯合應用還明顯增加caspase-3蛋白表達活性。這些結果提示，聯合用藥可能通過下調Bcl-2，上調Bax和caspase-3活性，誘導HSC-T6細胞的凋亡（圖2）。

圖2 各組細胞Akt和p-Akt蛋白表達的變化A：空白對照組；B：LY294002；C：1，25-（OH）2D3；D：聯合組

3 討論

HSC的激活和增殖能促進肝纖維化發生，肝纖維化程度隨著肝星狀細胞數量減少可得到明顯改善[14]，抑制HSC的增殖或誘導其凋亡可減輕甚至逆轉肝纖維化。HSC的激活、增殖和凋亡機制非常復雜，涉及許多細胞因子、調節蛋白及各種信號通路，所以找到并切斷肝星狀細胞增殖活化關鍵通路就成為抗纖維化的關鍵。近年來的多項研究表明，PI3K/Akt通路在HSC 增殖和凋亡中扮演重要角色[15]。在細胞調節過程中，細胞凋亡的增加與Bax/Bcl-2比值升高有關，凋亡的下降與caspase-3的減少有關[16]。LY294002作為此通路的特異性抑制劑，通過阻斷蛋白激酶Akt的磷酸化，從而增加細胞凋亡率。通常，在抗腫瘤治療過程中與放化療聯合應用,發揮增敏及協同作用,減少毒性作用,發揮抗細胞增殖效應，但已有學者研究證實應用促HSC 凋亡的藥物聯合PI3K/Akt抑制劑，將有效地抑制HSC增殖，促進HSC 的凋亡，減少ECM 的分泌[17～19]。

本科研組前期研究證實一定濃度的1，25-(OH）2D3 可通過調控HSC細胞周期使HSC停滯在G0/G1期，并誘導凋亡蛋白的表達，從而誘發大鼠肝星狀細胞的凋亡。此次實驗也表明，當PI3K/Akt信號通路被其特異抑制劑LY294002阻斷時，較大劑量的活性維生素D的干預明顯增強了LY294002誘導活化的HSC 凋亡作用，引起抗凋亡蛋白Bcl-2顯著降低，凋亡蛋白caspase3活性增加。兩者共同誘導HSC凋亡機制之一可能由Bcl-2/Bax通徑經過caspases來實現。與此同時LY294002 對HSC 增殖的抑制作用仍持續存在，故我們推測當PI3K/Akt信號通路被阻斷后，活性維生素D促HSC凋亡的作用被激活，同時增強了LY294002作用的敏感性，活性維生素D協同LY294002對HSC 的增殖抑制作用，并共同延緩肝纖維化的發生、發展，但其具體作用機制仍有待進一步研究。因此，我們認為維生素D抗纖維化治療的開展，不僅是活性維生素D單一作用的結果，可能是通過參與調控PI3K /Akt 信號通路，為今后維生素D抗肝纖維化治療指出了新方向。

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（收稿：2015-09-02）

（本文編輯：陳從新）

Inhibitory and apoptotic effect of LY 294002in combination with 1，25-dihydroxyvitamin D3 on HSC T6 cells in vitro

Wang Lei，Li Xiaotian，Zhang Li,et al.Chengde Medical College,
Department of Gastroenterology，Affiliated Hospital,Hebei Engineering University，Handan 056000,Hebei Province,China

Objective To invastigate the anti-proliferating and apoptotic effect of LY294002 and 1，25-dihydroxyvitamin D3（1，25-（OH）2D3）on hepatic stellate（HSC-T6）cells in vitro.Methods The HSC-T6 cells were divided into five groups,e.g.control,DMSO,1,25-（OH）2D3,LY294002 and 1,25-（OH）2D3 plus LY294002. The inhibitory effects were detected by MTT assay;The cell morphology was observed under microscopy;The apoptosis was detected by FCM,and the expression of Ser473,AKT and caspase-3 protein were assayed by Western blotting.Results The inhibitory rate in 1,25-（OH）2D3 plus LY294002 group was 87.5%，much higher than 50.3%in 1，25-（OH）2D3 or 40.3%in LY294002 group（P<0.05）after 48 h intervention；the apoptotic rate in 1,25-（OH）2D3 plus LY294002 group was 92.12%，much higher than 71.0%in 1，25-(OH）2D3 or 34.0%in LY294002-intervented group（P<0.05）；the ratio of Bax/Bcl-2 increased(P<0.05），and the expression of caspase-3 also increased obviously in 1,25-（OH）2D3 plus LY294002 group(P<0.05）.Conclusion LY294002 has an antifibrotic effect with the assistance of 1，25-（OH）2D3 on T6 cells in vitro.

T6 cells;LY294002;1，25-dihydroxyvitamin D3;Cell apoptosis；PI3 K/Akt signal pathway

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.02.006

河北省衛生廳重點科技研究計劃項目（編號：20150490）

056000 河北省邯鄲市承德醫學院研究生院（王蕾）；河北工程大學附屬醫院（李校天，張利，張九娜）第一作者：王蕾，女，26歲，碩士研究生。研究方向：慢性肝病的防治研究。E-mail: wangleiguantao@163.com

李校天，E-mail:xtianli@sina.com