強還原土壤對尖孢鐮刀菌的抑制及微生物區系的影響①

劉亮亮，黃新琦,2,3，朱 睿，張金波,2,3，蔡祖聰,2,3*

(1 南京師范大學地理科學學院，南京 210023；2 江蘇省物質循環與污染控制重點實驗室，南京 210023；3 江蘇省地理信息資源開發與利用協同創新中心，南京 210023)

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強還原土壤對尖孢鐮刀菌的抑制及微生物區系的影響①

劉亮亮1，黃新琦1,2,3，朱 睿1，張金波1,2,3，蔡祖聰1,2,3*

(1 南京師范大學地理科學學院，南京 210023；2 江蘇省物質循環與污染控制重點實驗室，南京 210023；3 江蘇省地理信息資源開發與利用協同創新中心，南京 210023)

摘 要：強還原土壤滅菌(reductive soil disinfestation，RSD)是一種抑制土傳病原菌的高效和環保的方法。本試驗通過熒光定量PCR和變性梯度凝膠電泳研究RSD對土壤尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)及微生物區系的影響。結果表明：處理15天后，較對照(CK)相比，除添加氨水處理(NH3)土壤pH上升外，以苜蓿粉和乙醇為有機碳源的RSD(Al-RSD和Et-RSD)處理土壤pH分別降低了0.54和1.16；NH3、Al-RSD和Et-RSD處理將尖孢鐮刀菌數量分別降低了74%、98% 和93%；Al-RSD顯著增加了細菌的數量和多樣性，Al-RSD和Et-RSD處理顯著降低了土壤中真菌的數量，但增加了真菌的多樣性。結果表明RSD與氨氣熏蒸相比對于土壤微生物區系的改善具有更好的作用。

關鍵詞：強還原土壤滅菌；土傳病害；尖孢鐮刀菌；微生物區系

香蕉是一種歷史悠久的水果，在世界上一度認為是繼水稻、小麥和玉米之后需求最大的農作物[1]，然而一場對香蕉具有毀滅性的土傳病害給香蕉產業帶來了極大的打擊。香蕉枯萎病，又稱巴拿馬病，是一種由尖孢鐮刀菌古巴專化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense，FOC)引起的、世界廣泛分布的土傳真菌病害[2]。FOC主要通過根部感染植株并寄生于根莖中，引起植株維管束壞死，導致香蕉樹枯萎[3]。該菌腐生能力強，即使沒有寄主，也能產生厚垣孢子在土壤中長期存活[4-5]。它的傳播途徑分為自然因素和人為因素，主要包括苗木、土壤、流水、耕作工具以及人等途徑傳播，其感染力高、致病力強、死亡率大，防治非常困難[6]。

目前，徹底防治香蕉枯萎病的方法仍未找到，而現階段采用較多的是物理防治、化學防治、培育抗病品種以及生物防治。物理防治如土壤暴曬法，雖然有一定的效果，但操作復雜，氣候條件限制性大；某些化學殺菌劑，如溴甲烷，具有很強的殺菌效果，但對食品和人類健康具有很大的安全隱患[7]；抗病品種在現階段倍受青睞，但在土傳病害防治上仍未發揮應有的作用[8]，且存在病原菌不斷積累的風險；由于具有環保、有效等優點，近年來生物防治土傳病害的相關研究越來越多，在國內外已有諸多學者采用生防菌抑制病原菌，如哈茨木霉、枯草芽孢桿菌等[9-10]，但外源添加的生防菌，它既要克服土著微生物的排斥，也要適應土壤以及周圍的環境，見效慢和效果不穩定[11]。

2000年，日本Shinmura[12]和荷蘭Blok等[13]人相繼采用強還原法(reductive soil disinfestation，RSD)殺滅土壤病原微生物，此方法是由向土壤中添加易分解有機碳源并維持土壤厭氧狀態組成，可在2～4周內殺滅大量土傳病原菌，目前作為化學熏蒸劑替代品廣泛用于農業生產中。國內黃新琦等[14-15]采用淹水方式實施RSD，雖然殺菌效果很明顯，但是對于持水力較差的土壤采用淹水方式操作較為困難，因此，本試驗采用添加有機物料后灌溉土壤至最大田間持水量并覆膜的方式實施RSD。此外，盡管RSD在日本和美國已取得一系列推廣應用，但已有的研究表明，RSD對土壤微生物區系影響的相關研究較少[16]，因此，本試驗研究了不同有機物料的RSD及氨氣熏蒸對于連作土壤中FOC、細菌和真菌數量及土壤微生物區系的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤：試驗地位于海南省樂東縣(109.17°E、18.75°N)香蕉種植園內，由于較高的香蕉枯萎發病率，此地塊已被撂荒一年。該土壤pH 6.5，電導率40.8 μS/cm，有機碳和全氮含量分別為9.46 g/kg與0.43 g/kg。供試有機物料：苜蓿粉和乙醇。供試氨水濃度為25%。

1.2 試驗處理

試驗分為4個處理：原位土壤(CK)、土壤中添加500 ml/m2氨水后灌溉至最大田間持水量并覆膜(NH3)、土壤中添加2 kg/m2苜蓿粉后灌溉至最大田間持水量并覆膜(Al-RSD)、土壤中添加1 L/m2乙醇后灌溉至最大田間持水量并覆膜(Et-RSD)，每個處理3個重復，每個重復面積為1 m ×1 m。處理期間溫度25～35℃，處理周期為15 天，處理完成后揭膜，分別采取各處理0～20 cm和20～40 cm土層的土壤。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤pH的測定 將土壤與去離子水以1︰2.5的比例混勻，然后以200 r/min在搖床中振蕩30 min后用pH計(Mettler S220K，Switzerland)測定土壤pH。

1.3.2 土壤DNA的提取 土壤DNA提取使用試劑盒Power SoilTMDNA Isolation Kit(MO BIO Laboratories Inc.，USA)。

1.3.3 實時熒光定量PCR對真菌、細菌和FOC的定量 本試驗通過實時熒光定量PCR和相應的特異性引物對真菌、細菌和FOC進行定量。定量PCR擴增采用8聯管在CFX96TMReal-Time System(Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules， CA，USA)上進行。每個PCR管的反應體系總量為20 μl[17]：2 μl DNA模板，10 μl SYBR Green premix EX Taq(2×)，正反引物各1 μl(真菌特異性引物：ITS1-f和5.8 s；細菌特異性引物：Eub338和Eub518；FOC特異性引物：ITS1-F 和AFP308，表1)，6 μl無菌水。真菌和細菌的反應條件：95℃ × 2 min預變性，95℃ × 10 s高溫解鏈，53℃ × 20 s低溫退火，72℃ × 30 s延伸，40個循環；FOC反應條件：95℃ × 2 min預變性，95℃ × 10 s高溫解鏈，58℃ × 15 s低溫退火，72℃ × 20 s延伸，40個循環；在每個循環的延伸階段采集熒光信號，并在反應結束后繪制熔解曲線。標準品的構建參照文獻[18]，得出的真菌、細菌及FOC標準曲線分別為：y = -3.003 0x + 47.779，R2= 0.999；y = -3.368 0x + 49.903，R2= 0.996 1；y = -3.358 6x + 51.282，R2= 0.995 3。

1.3.4 變性梯度凝膠電泳檢測土壤微生物多樣性 對土壤DNA進行PCR擴增所使用的細菌引物為GCU968(GC夾子40 bp)和L1401，真菌引物為GC-Fungi 和NS1(表1)。PCR反應體系總量為25 μl：1 μl DNA模板，正反引物各1 μl，12.5 μl Mix Taq(2×)，9.5 μl無菌水。細菌PCR反應條件為94°C × 5 min預變性，94℃ × 10 s高溫解鏈，52℃ × 20 s低溫退火，72℃ × 30 s延伸，32個循環，72℃ × 10 min再延伸；真菌PCR反應條件：95℃ × 5 min預變性，94℃ × 20 s高溫解鏈，55℃ × 20 s低溫退火，72℃ × 30 s延伸，32個循環，72℃ × 7 min再延伸。PCR擴增后的產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

表1　實時熒光定量PCR與PCR-DGGE引物列表Table 1 The primers used in quantitative real-time PCR andPCR-DGGE

采用D-Code System(Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA，USA)進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)，在6%(w/v)的聚丙烯酰胺凝膠(40% acrylamide/bisacrylamide，37.5︰1，Bio-Rad)中加入等量濃度PCR產物，然后以60℃、80 V進行電泳，持續16 h。細菌和真菌的變性梯度分別為45%～60% 和25%～40%，通過成像儀和Quantity One 4.6.3對電泳效果進行檢測及分析。

1.4 數據處理與分析

采用Excel 2003、Origin 8.0和SPSS 19.0(SPSS Inc.，Chicago，USA)統計分析軟件對土壤pH、微生物數量(細菌、真菌和FOC)及微生物多樣性數據進行處理與分析，并結合LSD多重比較法檢驗各處理間的差異顯著性(P＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 土壤pH的變化

處理15天揭膜后，0～20和20～40 cm土層：NH3處理的pH較CK分別顯著增加了1.29和1.06；而Et-RSD處理的pH較CK分別顯著降低了1.3和0.34。Al-RSD處理0～20 cm土層pH較CK降低了0.54，但20～40 cm土層顯著增加了0.53(圖1)。

圖1　處理結束后原位土壤(CK)、添加氨水(NH3)、苜蓿粉RSD處理(Al-RSD)和乙醇RSD處理(Et-RSD)的土壤pHFig.1 Soil pH in untreated soil(CK),treated with NH3,RSD with alfalfa(Al-RSD),and RSD with ethanol(Et-RSD)at the end of treatments

2.2 土壤真菌和細菌數量變化

處理結束后，0～20 cm土層，NH3處理的真菌數量較CK無顯著差異，Al-RSD和Et-RSD處理的真菌數量(1.26 × 108、7.05 × 107copies/g)較CK(4.29×108copies/g)分別顯著降低了71% 和 84%(圖2)；20～40 cm土層，除Al-RSD處理的真菌數量(3.16 × 108copies/g)較CK(1.59 × 108copies/g)顯著增加了97% 之外，NH3和Et-RSD處理較CK都無顯著變化。Al-RSD處理0～20 cm、20～40 cm的細菌數量(4.21 × 1010、2.48 × 1010copies/g)較CK(1.90 × 1010、1.11 × 1010copies/g)分別顯著增加了121.42% 和123.42%，NH3和Et-RSD處理的土壤細菌數量與CK比較差異均不顯著(圖2)。

圖2　處理結束后土壤真菌和細菌數量Fig.2 Populations of bacteria in soils at end of treatments

2.3 尖孢鐮刀菌(FOC)數量及其占真菌比重

處理結束后，0～20 cm土層，NH3、Al-RSD和Et-RSD處理的FOC數量(3.32 × 106、2.63 × 105、8.63 × 105copies/g)較CK(1.28×107copies/g)分別顯著降低了74%、98% 和93%。NH3處理20～40 cm 土層FOC數量與CK相比差異不顯著，但Al-RSD和Et-RSD處理較CK分別顯著降低了71% 和61%(圖3)。

圖3　處理結束后土壤FOC數量Fig.3 Populations of FOC in soils at end of treatments

根據FOC與真菌的數量可知FOC在4個處理土壤中占真菌的比重。0～20 cm土層，CK處理FOC占真菌的比重最高，NH3、Al-RSD和Et-RSD處理FOC占真菌的比重較CK分別顯著下降了66%、92% 和64%。20～40 cm土層，NH3處理FOC占真菌比重與CK相比差異不顯著，Al-RSD與Et-RSD處理分別顯著下降了83% 和55%(表2)。

表2　尖孢鐮刀菌占真菌比重(%)Table 2 Proportions of FOC in Fungi

2.4 土壤微生物多樣性的變化

采用Quantity one 軟件對DGGE圖譜(圖4)進行分析后，選用Shannon-Weaver指數(H′)、豐度(S)并結合聚類分析構建系統發育樹分析各處理土壤微生物多樣性[26]。從圖4可以看出Al-RSD處理土壤細菌條帶數量和組成較CK處理相比發生了明顯變化。從表3可知細菌的H′ 和S的大小排列依次為Al-RSD、Et-RSD、NH3和CK，并且Al-RSD的H′ 和S與另3個處理差異相比均顯著增加，表明Al-RSD處理細菌物種多樣性最豐富；真菌的H’ 和S的大小排列依次為Et-RSD、Al-RSD、NH3和CK，并且Al-RSD和Et-RSD的H′與S與CK相比均顯著增加，表明Al-RSD和Et-RSD處理真菌的物種多樣性最為豐富。從圖5可知，NH3和Et-RSD處理中的細菌群落具有較高的相似度；CK與NH3、Al-RSD與Et-RSD間的真菌群落也具有較高相似度。

圖4　處理結束后細菌和真菌DGGE圖譜Fig.4 DGGE profiles of bacteria and fungi at end of treatments

表3　各樣品微生物多樣性分析結果Table 3 Microbial diversities of four treatments

圖5　聚類分析系統發育樹Fig.5 Clustering analysis of phylogenetic tree

3 討論

Stover[4]通過土壤淹水方式殺滅引起香蕉枯萎病的FOC，但是耗時近4個月，且殺菌效果不好。黃新琦等[14]研究結果也表明單獨淹水在短時間內并不能很好地抑制病原菌，但是淹水同時添加有機物料使土壤呈現強烈還原狀態顯著地降低了土壤中FOC數量，本試驗結果與此相似。然而，對于持水力較差的土壤采用淹水方式操作較為困難，且費時費水，所以本試驗采用添加有機物料后灌溉土壤至最大田間持水量并覆膜的方式實施RSD，結果表明此方法也能取得較好的殺菌效果。

已有的研究報道表明[13,27]，RSD的殺菌機理可能有：厭氧狀態、抑菌物質(有毒有機酸和還原性產物)以及土壤微生物群落結構的改變。本試驗中Al-RSD和Et-RSD處理0～20 cm的pH降低是由于在厭氧條件下，微生物分解有機物料產生有機酸所致，然而這些有機酸在土壤轉為好氧狀態后便會很快揮發或分解，并不會導致土壤酸化[17]。研究表明，RSD過程中產生的某些有機酸，如乙酸和丁酸對FOC具有很強的抑制作用[17,28]，Al-RSD和Et-RSD處理土壤中FOC數量急劇下降可能是RSD過程中產生的有毒有機酸所造成的。相關研究表明氨氣對于土傳病原菌具有較好的抑制效果[29]，本試驗中NH3處理0～20 cm FOC顯著下降可能是因為氨水熏蒸具有直接的殺菌作用。

土壤微生物區系對植物生長至關重要，它是衡量土壤微生物多樣性和肥力的一個重要指標[30]。而土壤微生物多樣性也是土壤生態系統穩定性及土壤生產力一個重要組成部分[31]。有研究表明植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)在防治土傳病害和促進植物生長方面也具有重要的作用[32]。本試驗中Al-RSD處理的細菌數量較CK顯著增加，而Et-RSD處理較CK相比無顯著差異，可能是因為苜蓿粉中有機碳源比較豐富，從而促使能利用這些碳源的細菌增加；而Et-RSD處理中碳源單一，能利用乙醇的細菌較少。此外，尤為重要的是Al-RSD處理顯著地增加了土壤細菌多樣性，改善了土壤微生物區系。Mowlick等[33]人研究指出在RSD過程中會產生許多厭氧細菌，其中以厚壁菌門梭菌屬Clostridia和芽孢桿菌屬Bacilli為主，其產生的孢子可以快速生長并繁殖為優勢種，從而抑制病原菌的生存，本研究中RSD處理后所增加的新菌種可能與之相似。然而，Mowlick等[16]指出RSD處理后細菌多樣性與處理前相比顯著降低，與本試驗結果相反，原因可能是DGGE與克隆文庫檢測的靈敏度不一，或不同有機碳源的RSD對不同土壤微生物區系的影響不盡相同。就真菌而言，RSD處理均顯著減少了真菌數量，但顯著增加了土壤真菌多樣性，這對后續植物的健康生長至關重要。雖然利用氨水熏蒸對土壤病原微生物有一定的抑制效果，但其對土壤微生物區系的改善并無明顯作用，同時還存在著許多問題，如處理后不能及時種植，否則會出現嚴重的燒苗現象[29]。相比而言RSD處理不僅減少了土壤中病原菌的數量，而且顯著增加了土壤微生物多樣性，改善了土壤微生物區系。

雖然Blok等[13]提到采用固體有機物料的RSD操作耗費勞動力的缺點，Momma等[34]人研究表明其殺菌效果不如乙醇，但是本研究表明采用固體有機物料的RSD對土壤微生物區系的改良效果要優于乙醇處理，此外還可以解決秸稈處理一直存在的困境從而變廢為寶[35]。因此，乙醇和作物秸稈相結合的RSD對于退化土壤的改良效果可能會更佳，這有待進一步研究。

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Influences of Reductive Soil Disinfestation on Fusarium oxysporum and Soil Microbiome

LIU Liangliang1,HUANG Xinqi1,2,3,ZHU Rui1,ZHANG Jinbo1,2,3,CAI Zucong1,2,3*
(1 School of Geography Science,Nanjing Normal University,Nanjing 210023,China; 2 Jiangsu Provincial Key Laboratory of Materials Cycling and Pollution Control,Nanjing 210023,China; 3 Jiangsu Center for Collaborative Innovation in Geographical Information Resource Development and Application,Nanjing 210023,China)

Abstract:Reductive soil disinfestation(RSD)is an effective and environmentally-friendly method to suppress soil-borne pathogens.Real-time PCR and denaturing gradient gel electrophoresis were performed to investigate the influences of RSD on Fusarium oxysporum and soil microflora.Results showed that in 15 days after treatment,except for the NH3treatment,soil pH in Al-RSD and Et-RSD treatments decreased by 0.54 and 1.16 compared with that in the control treatment.NH3,Al-RSD and Et-RSD significantly reduced the numbers of Fusarium oxysporum in soil by 76%,98% and 94%,respectively.Al-RSD significantly increased the populations and diversities of bacteria.Al-RSD and Et-RSD significantly decreased the populations of fungi in the upper soil,but increased the fungal diversities.These results indicated that RSD has a better effect on the improvement of soil microflora compared with ammonia fumigation.

Key words:Reductive soil disinfestation; Soil-borne disease; Fusarium oxysporum; Soil microflora

作者簡介：劉亮亮(1990—)，男，江西永新人，碩士研究生，主要從事土壤微生物及土傳病害生物防控等方面研究。E-mail:15996230060@ 163.com

* 通訊作者(zccai@njnu.edu.cn)

基金項目：①國家自然科學基金項目(41301335)、中國博士后科學基金項目(2014M551622)和江蘇高校優勢學科建設工程項目資助。

DOI:10.13758/j.cnki.tr.2016.01.014

中圖分類號：S154.3