采用基因鑒定方法控制微生物污染

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采用基因鑒定方法控制微生物污染

利用遺傳基因方法檢測和鑒定導致紙廠清水系統污染的微生物，一旦某種微生物被確定，即可采用現有殺菌劑制訂最適宜的方案有效地處理問題微生物。與傳統方法相比，該方法具有快速、準確和操作簡單的特點。該文介紹了這一新型實用的微生物污染控制方法及其在6家紙廠的應用情況。

造紙系統中清水的污染會導致絲狀菌沉積，其沉積物統稱為“粉紅泥渣”。采用現代微生物控制系統難以處理這些沉積物，而紙廠的腐蝕現象令工廠擔憂。我們采用DNA指紋圖譜分析鑒定清水中的污染微生物，一旦微生物被分離和確定，即可采用現有殺菌劑制訂最適宜的方案并有效地處理沉積物。盡管可以采用類似的方法鑒定這些問題微生物，但是控制這些問題微生物所用的最佳產品以及所需要的最低抑菌濃度（MIC）差別較大。

采用現代前沿技術鑒定問題微生物，不僅可以為客戶提供先進的控制助劑，而且可以將這些結果信息輸入數據庫，有助于識別和處理其他工廠出現的問題。

1　概述

眾所周知，微生物會通過原材料、水、土壤和空氣等多種渠道進入造紙生產系統。造紙生產過程中微生物的不可控生長會給生產系統帶來各種問題，包括產生臭味、紙斑、斷紙、粘滑、管道堵塞和腐蝕等。通常采用殺菌劑、分散劑或者煮沸的方法控制微生物。

對生產系統的微生物進行深入檢測對制備有效的微生物控制劑會大有幫助，因為檢測結果會提供微生物的種類、性質和相對多度。檢測通常采用顯微鏡、肉眼觀測、ATP檢測和微生物平板計數法。

利用DNA法檢測和鑒定微生物越來越普遍。將DNA法用于皮革工業和制漿造紙工業，對于深入了解微生物菌群在這些環境中的知識具有重要意義。如果這些方法能夠有效檢測和鑒定紙廠中的問題微生物，這將有利于紙廠微生物的污染控制。

本文介紹了基因鑒定方法，該方法能夠有效鑒定微生物，且常與其他檢測方法聯合共同用于微生物的控制。與此同時，本文也介紹了將這些方法用于控制6家工廠中“粉紅泥渣”沉積的結果。

2　細菌的取樣和分離

采用DNA檢測法的第1步是選擇取樣點，通常會選擇含有水和腐漿沉積物的幾個點，將腐漿沉積物連同水一并收集，然后送入實驗室進行微生物分析。樣品送入實驗室后需要立即進行處理分析。利用生理鹽水對樣品進行連續稀釋，然后置于計數培養基、R2A培養基、Stokes培養基和放線菌分離培養基中培養。將培養基置于溫度30℃或溫度45～50℃環境中（具體溫度取決于現場條件）培養2～7天，選擇菌落，重新劃線以獲得純培養細菌；也可以采用平板劃線法分離細菌，但是我們通常采用連續稀釋的方法，因為該方法有助于評估容易產生污染的細菌數量。

3　 DNA制備

基因鑒定細菌法是基于美國應用生物系統公司（Applied Biosystem，位于加利福尼亞福斯特城）的MicroSep系統。該方法需要利用純培養細菌的DNA。采用配套的PrepMan Ultra試劑盒提供的儀器從純培養細菌中提取DNA。

4　基因擴增

在獲取DNA之后，需要進行聚合酶鏈反應（PCR）。PCR是一種基因擴增技術，并能復制百萬計的具有特定基因序列的DNA。鑒定真細菌時，16S rRNA基因被擴增。該基因可用于大多數細菌的鑒定，因為16S rRNA存在于所有細菌的基因組中。16S rRNA基因具有保守性，在基因變革過程中，16S rRNA幾乎保持恒定。此外，16S rRNA具有顯著的序列變異區，用以區分和鑒定不同種類的細菌。

PCR反應混合液包括DNA模板、反應引物、熱穩定的DNA聚合酶、核苷酸（dNTP）、鎂離子和緩沖溶液。MicroSeq 500 16S rRNA細菌鑒定PCR Kit系統包括所有16S rRNA基因擴增的試劑和方法。

在反應的最后，選取反應混合物試樣和瓊脂糖凝膠來確定PCR反應是否成功。如果能夠在凝膠上觀測到預期產物帶，則PCR反應成功，最后需要清洗最終產物中的未反應試劑。

5　 16S rRNA基因序列和數據分析

清洗后的擴增DNA用于循環測序，主要是分析特定DNA片段的堿基（ATGC）序列或排列方式。循環測序法采用4種不同的熒光染色劑標記DNA中的相應堿基。

各菌系的16S rRNA基因序列采用MicroSeq 500 16S rRNA細菌鑒定系統確定。循環測序之后，按照廠商提供的方法清洗反應混合物，去除未反應試劑和未聯合染色劑。

然后，將經循環測序后的反應產物置于自動DNA測序儀上進行電泳測試。

利用美國應用生物系統公司的MicroSeq微生物分析和數據庫系統進行序列分析和細菌鑒定。如果未找到匹配的細菌系列，則需要開展GenBank或Ribosomal數據項目的BLAST研究進行可能的匹配。

6　結果與討論

在制定適宜的微生物污染控制體系之前，需要應用基因鑒定系統，分析粉紅泥渣沉積物中“粉紅泥渣”的組分。實驗所用試樣分別取自美國、中國、德國和捷克的工廠，進行具體鑒定實驗的純培養細菌來自其中的3家工廠。對于余下的試樣，嘗試分離粉色或紅色細菌。

在進行研究的6家工廠中，產生粉紅泥渣的主要細菌源包括Flectobacillussp、Runellasp、Meiothermusruber、Deionococcusgeothermalis和Serratiamarcescens。表1所示為不同工廠的細菌鑒定結果。

表1　6家工廠沉積物中“粉紅泥渣”的細菌組成

Flectobacillus sp.是粉紅絲狀細菌，本研究發現在3家工廠中都含有這種細菌。根據在其他工廠的研究經驗，認為這種粉紅絲狀細菌是導致現代紙機粉紅泥渣產生粉紅色的主要原因。在其中的一家工廠中，同時發現了Flectobacillus sp.和紅色短桿菌Rhodovariuslipocyclicus。Rhodovarius sp已被發現存在于其他領域，但是并未有發現該細菌存在于紙機環境中的信息。

在其中一家工廠，產生粉紅泥渣的原因是Runellasp絲狀細菌，這些細菌是從廢水處理廠和水體中分離而來，但是至今為止，尚未發現其他紙廠中出現這類細菌的信息報道以及這些細菌與粉紅泥渣之間聯系的報道。

Meiothermusruber和Deionococcusgeothermalis是其中一家工廠產生粉紅泥渣的原因。在這家工廠中，Meiothermusruber被認為是粉紅或紅色細菌的主導。這些有機微生物是中毒嗜熱菌，在溫度45～50℃時被分離。泥渣沉積物中Meiothermussp和Deionococcusgeothermalis是導致紙廠產生紅色或粉紅泥渣的原因，這一觀點已有相關報道。

20世紀50年代，有研究認為紙廠中的粉紅泥渣主要與Serratiasp有關，但是近年來眾多的研究表明，除Serratiasp之外許多其他的細菌也是產生粉紅泥渣的原因。其中，在本研究中的一家工廠，我們發現Serratiamarcescens是主要的粉紅或紅色細菌，且是紙廠中產生粉紅泥渣的原因，如圖1和圖2所示。近年來對Serratiasp研究較少的原因主要包括設備設計和運行、造紙工藝、漿料種類、殺菌劑及其他助劑的變化。

實驗中，大量的細菌被分離且進行了16S rRNA基因測序，但是不能最終“命名”這些細菌，因為某些細菌未被完全表征或者在實驗條件下未進行純培養，所有這些細菌被認定為“未培養/未鑒定”細菌。采用序列鑒定法進行檢測的其中一個優點是，可以將這些“未培養/未鑒定”細菌保存在研究數據庫中，以便在未來的研究中應用。龐大的數據庫以及控制細菌的經驗為粉紅泥渣的研究提供了可靠的工具。

綜上所述，本研究所用的鑒定系統具有比傳統方法更加快速、準確和簡便的特點。這種方法可以在短時間內鑒定大量的微生物。16S rRNA基因序列儲存在數據庫中，在需要時可以隨時查詢。此外，還可以確定大多數微生物對各種不同的控制劑的敏感性，這一信息可用于在特殊情況下及時作出控制細菌的合適決策。

（楊揚編譯）

圖1　 Serratiamarcescen“s紅色泥渣”

圖2　 Serratiamarcescens培養細菌