青藏高原高寒草地優勢禾草-紫花針茅內生真菌分離和鑒定

鮑根生，李春杰

(1.草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730020;2.青海大學畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016)

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青藏高原高寒草地優勢禾草-紫花針茅內生真菌分離和鑒定

鮑根生1,2，李春杰1*

(1.草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730020;2.青海大學畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016)

摘要：紫花針茅作為青藏高原高寒草原群落中主要優勢禾草之一，關于該植物所感染禾草內生真菌的形態和分類研究尚未見報道。本研究采用分離培養獲取不同樣點的紫花針茅內生真菌菌落，利用特異性引物克隆紫花針茅內生真菌序列，并與Genbank中下載的序列共同構建系統進化樹。結果表明，青海省紫花針茅樣品帶菌率高達100%，而其他區域樣品均不帶菌。分離的內生真菌菌落從菌落形態、生長速度及分生孢子形態等特征均與Epichloё屬內生真菌的形態特征相似。系統進化關系表明，它們分別與北美洲豎針茅體內無性態內生真菌Epichloё chisosa、醉馬草內生真菌Epichloё inebrians及甘肅內生真菌Epichloё gansuensis具有較近的親緣關系，進一步說明紫花針茅所感染內生真菌與宿主間未體現出嚴格的宿主特異性。

關鍵詞：青藏高原；紫花針茅；內生真菌；系統發育；宿主

紫花針茅(Stipapurpurea)隸屬禾本科針茅屬[1]，多年生草本，系寒旱生植物，粗蛋白含量高，粗纖維少，營養價值比較高[2-3]。主要分布在海拔1900～5150 m的高原地帶，是青藏高原、帕米爾高原和中亞高山地帶的特有植物[4-5]。紫花針茅草原是青藏高原地區高寒草地中分布面積較廣、最具有代表性的草地類型，其面積占高寒草原類草地總面積的30.92%[6-7]；其建群種紫花針茅具有耐寒、耐旱、耐踐踏和抗風沙等特性[8-10]。

目前有關紫花針茅研究主要集中在基因多樣性、群落分類、生理生態和草原群落等方面[3,5-6,9,11-16]。然而，有關紫花針茅感染的微生物及與微生物間互作研究較少，李振東等[17]分離紫花針茅體內內生細菌，發現內生細菌具有較強的抑菌活性。南志標和李春杰[18]研究發現，紫花針茅帶菌高達67%；同時，筆者在青海高原禾草內生真菌帶菌率檢測研究發現，紫花針茅帶菌率高達100%(數據未發表)。

麥角菌科的內生真菌與冷季型禾草在長期進化過程中形成了互惠共生關系[19-23]。內生真菌不僅能提高宿主對逆境的適應性[24-29]，同時合成的次生代謝物能提高草食家畜和昆蟲的拒食性[30-34]；而宿主為內生真菌提供生活的場所和生長所需的營養物質[20,35-36]。Leuchtmann等[37]將Neotyphodium屬內生真菌歸類到Epichloё屬，總計43種禾草內生真菌。目前，分子系統發育分析已廣泛應用于禾草內生真菌分類和系統進化研究中，其中保守區的編碼蛋白(tubB)、轉錄延長因子(tefA)和肌動蛋白(actG)基因序列被用來區分不同宿主體內內生真菌的分類[38-39]。本研究利用形態學和分子標記的方法，通過菌落和分生孢子形態比較，構建系統發育樹，對紫花針茅內生真菌進行歸類并進行分子鑒定，為今后紫花針茅在高寒逆境條件下適應性和利用內生真菌抗逆性育種提供新思路。

1材料與方法

1.1供試材料

紫花針茅植物樣品主要在青藏高原地區天然高寒草地上采集，于2012年至2014年8-9月在牧草成熟季節，在西藏阿里地區、青海省、四川省西北部和甘肅省南部采集紫花針茅單株樣品22份。采集區域介于北緯30°14′54.0″-37°19′50.2″，東經79°55′47″-102°32′42″，草地類型主要以高寒草原為主(表1)。每個采樣點間隔10 m，隨機采集10～20株紫花針茅單株地上部分放入信封，編號后帶回實驗室。

1.2內生真菌分離和培養

每個單株挑選5粒種子，參照李春杰等[39]的方法進行種皮和糊粉層內生真菌檢測，具體方法參照Iannone等[40]的方法。選取帶菌種子進行表面消毒，具體方法為：先用70%酒精消毒1 min，然后用1%次氯酸鈉消毒3～5 min,用無菌水沖洗3～5次，用滅菌濾紙吸干種子表面殘留的液體，隨后將種子擺放到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基上，在25℃黑暗條件下培養1月。在種子表面形成菌落后，在邊緣挑取少許菌絲在PDA培養基上進行培養，待產孢后挑取單個孢子在25℃黑暗條件下進行純培養，每周測量菌落直徑，4周后進行分生孢子和分生孢子梗形態觀察和大小測量。

1.3DNA分離、擴增和純化

參照高效真菌DNA提取試劑盒(OMEGA公司)提取DNA方法， 用單孢培養菌落的10～50 mg 新鮮的紫花針茅內生真菌菌絲提取內生真菌全基因組，分別用tubB(5′-GAGAAAATGCGTGAGATTGT，3′-GTTTCGTCCGAGTTCTCGAC),tefA(5′-GGGTAAGGACGAAAAGACTCA，3′-CGGCAGCGATAATCAGGATAG)和actG(5′-GAAGTTGCTGCCCTCGTTATC，3′-AACCACCGATCCAGACAGAGT) 3對引物對內生真菌基因組進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。PCR選用25 μL體系，包括5 ng DNA模板、1.0 U Taq DNA聚合酶、1×PCR緩沖液、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTP (dATP、dCTP、dGTP、dTTP)和1 μmol/L上、下游引物。PCR循環參數設定為：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，50℃退火1 min，35個循環，最后，72℃延展10 min，并在4℃保持。將PCR擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，回收片段連接于pGEM?-T Easy載體(Promega生物公司)并轉入大腸桿菌DH5α。每個樣本挑選5個陽性克隆，并送交蘭州勵合生物技術公司進行測序。所測序列提交至GenBank數據庫，tubB序列登錄號為KP877323～KP877330，tefA序列登錄號為KP877315～KP877322，actG序列登錄號為KP877331～KP877338(表1)。

表1　紫花針茅分離內生真菌編號和美國生物技術信息

1.4序列比對及系統發育分析

用紫花針茅內生真菌tubB、tefA和actG測序序列在NCBI基因數據庫中Blast程序搜索直系同源序列，挑選禾草內生真菌相關的tubB、tefA和actG序列(表2)。由于NCBI提交的不同內生真菌不同標記序列長度存在差異，根據Craven等[38]和Gentile等[41]提出tubB、tefA和actG序列差異主要體現在內含子區域差異的觀點，所以所用序列去除外顯子而保存內含子進行系統發育分析[37,40]。用Clustal X進行比對，比對結果中有歧義的位點進行人工優化。比對結果采用PAUP*4.0b10軟件中最大簡約法(maximun parsimony,MP)構建系統發育樹。空白位點作為缺失信息處理，同時，每個位點狀態不排序且權重相等。采用啟發式搜索獲取最大簡約樹，用Bootstrap自展法1000次重復，并將自展值大于50值標記到進化樹分枝上。

2結果與分析

2.1紫花針茅內生真菌分離和形態特征

2012-2014年分別從青藏高原地區22個樣點采集紫花針茅植物樣品，其中青海省11個樣點采集紫花針茅帶菌率高達100%，而西藏阿里、日喀則、那曲地區9個樣點紫花針茅不帶菌，四川省和甘肅省2個樣點紫花針茅亦不帶菌(表2)。青海省紫花針茅分布樣點共分離獲得8個菌株，分離菌株的菌落形態相似。在25℃黑暗培養條件下，PDA培養基上生長緩慢，平均生長速率為11～15 mm/周；菌落正面白色棉質，質地致密，氣生菌絲發達，菌落中央隆起，邊緣整齊(圖1B)；反面從中央到邊緣由暗褐色變成黃色(圖1C)。分生孢子單生于分生孢子梗頂端，光滑、透明、無隔，舟形或腎形，(3.2～7.3) μm×(2.6～3.3) μm(圖1E)；分生孢子梗基部單生或基部生成兩個分枝，長8.4～28.0 μm，基部寬1.5～2.9 μm，頂端寬0.6～1.1 μm(圖1D～E)。以上特征均符合Epichloё屬內生真菌的形態特征。

2.2系統發育分析

將紫花針茅分離的8個菌株(stpu2、stpu19、stpu25、stpu27、stpu41、stpu49、stpu51、stpu54)的總DNA為模板，利用tubB、tefA和actG3個管家基因為引物分別擴增目的片段基因，各個引物只擴增到一個目的片段，未發現其他拷貝。通過NCBI比對后，分別抽取54， 52， 53條禾草內生真菌tubB、tefA和actG序列； 構建tubB系統

表2　紫花針茅采集樣點及內生真菌帶菌率檢測

發育樹的序列比對后長度為522 bp， 其中包含156個保守位點、297個變異位點和192個簡約位點；構建tefA系統發育樹的序列比對后長度為495 bp，包含166個保守位點、325個變異位點和166個簡約位點；構建actG系統發育樹的序列比對后長度為512 bp，包含292個保守位點、335個變異位點和204個簡約位點。

圖1　紫花針茅內生真菌菌絲、PDA菌落形態、分生孢子梗和分生孢子結構　Fig.1　Photographs of hyphae, colony and conidial morphology isolated endophytes from S. purpurea 　　　A:種皮內內生菌絲形態; B～C:菌落正反面形態; D～E:分生孢子和分生孢子梗形態；菌落大小標尺長度為 10 mm, 分生孢子和分生孢子梗大小標尺長度為20 μm。A: Fungal hyphae within seed coat; B-C: Morphology of upper and reverse of colony; D-E: Size and morphologies of conidial; Scale bar for colony pictures is 10 mm, and for conidia pictures, 20 μm.

tubB序列構建的系統發育樹顯示，紫花針茅分離的8個菌株與Epichloёgansuensis和E.chisosa非常接近(圖2a)。其中，stpu2、stpu19、stpu27和stpu41與分離于北美洲的豎針茅(Achnatherumeminens)體內無性態內生真菌E.chisosa聚到一起，自展值分別高達100%和84%，形成兩個明顯亞枝；而stpu25、stpu49、stpu51和stpu54與分離于我國醉馬草(Achnatheruminebrians)內生真菌E.inebrians聚到一起，同時還與北美洲的毛邊臭草(Melicaciliata)感染的E.guerinii、內蒙古羽茅(Achnatherumsibiricum)感染的E.sibiricum和醉馬草(A.inebrians)感染的E.gansuensis共同形成一個分支，自展值達到64%。

圖2　紫花針茅stpu內生真菌系統進化最大簡約樹Fig.2　Phylogenetic trees of Epichloё sp. based on maximum parsimony (MP) analysis of sequences from intron portions　(a) tubB:樹長522 each of 522 steps，一致性指數Consistency index (CI)=0.7605；保留指數Retention index (RI)=0.8957；復定一致性指數Rescaled consistency index (RC)=0.6812；(b) tefA:樹長=495 each of 495 steps，CI=0.820，RI=0.926，RC=0.759；(c)actG:樹長=512 each of 512 steps，CI=0.883，RI=0.935，RC=0.825。將Claviceps purpurea (AF276506、AF276508和AF276509)作為外群；進化樹上只顯示自展值大于50%的節點值。The Claviceps purpurea (AF276506, AF276508, AF276509) was designated as the outgroup for rooting trees. Numbers associated with branches were bootstrap support percentages (≥50%) assessed with 1000 replications.

續圖2　紫花針茅stpu內生真菌系統進化最大簡約樹Continued Fig.2　Phylogenetic trees of Epichloё sp. based on maximum parsimony (MP) analysis of sequences from intron portions

續圖2　紫花針茅stpu內生真菌系統進化最大簡約樹Continued Fig.2　Phylogenetic trees of Epichloё sp. based on maximum parsimony (MP) analysis of sequences from intron portions

tefA序列構建的系統發育樹拓撲結構與tubB相似(圖2b)，其中，sp2、sp19與豎針茅感染的E.chisosa、北美洲的類雀麥(Bromusramosus)和直立雀麥(Bromuserectus)感染的E.bromicola、硬直黑麥草(Loliumrigidum)感染的E.occultans、短穎草(Brachyelytrumeretum)感染的E.brachyelytri聚到一支；而sp27、sp41與豎針茅感染的E.chisosa和草地早熟禾(Poapratensis)感染的E.typhina單獨形成另外一個亞枝。其他4個菌株與醉馬草感染的E.gansuensis單獨形成一支，自展值高達86%。

與tubB和tefA系統發育樹不同，紫花針茅actG拓撲結構只形成兩個明顯分支(圖2c)，其中stpu2、stpu19、stpu27、stpu41與豎針茅感染的E.chisosa形成單一分支，自展值高達91%；而其他4個菌株與醉馬草感染的E.gansuensis形成另外一個分支，自展值達到78%。

3討論

針茅族隸屬禾本科早熟禾亞科，目前全球約有600種，主要分布在亞歐大陸、美洲和澳大利亞等地，成為溫性草原群落中的主要建群禾草之一[42]。近年來，隨著學者們對禾草內生真菌共生體研究的日益關注，通過內生真菌檢測和分離技術，先后從北美洲的豎針茅和睡眠草(Achnatherumrobustum)中分別分離到Epichloёchisosa和E.funkii[43-44]，中國醉馬草中分離到E.gansuensis和E.inebrians[45-46]，中國內蒙古地區羽茅中分離到E.siegelii[47-48]，總共5種Epichloё屬內生真菌。這些內生真菌在菌落生長速度和分生孢子形態上均表現出差異。例如，菌落生長速度以豎針茅分離的內生真菌最慢，而臭草(Melicaracemosa)和睡眠草內生真菌菌落生長速度最快，羽茅、紫花針茅和醉馬草菌落生長速度居中；睡眠草內生真菌的分生孢子最大，而羽茅內生真菌孢子較小；睡眠草和羽茅內生真菌分生孢子梗最長，而醉馬草內生真菌孢子梗最短[43-45,49]。可見，不同類型內生真菌菌落生長特性主要取決于不同內生真菌的基因型和營養條件差異[49-50]。同時，由于睡眠草感染的內生真菌是E.typhina和E.festucae雜交而來，基因組明顯大于兩個親本，同時許多雜交形成的內生真菌在外部形態上也明顯表現出比親本菌落生長較快、分生孢子和分生孢子梗較大較長等特點[41,44,51]。

Moon等[44]研究發現，北美洲豎針茅感染的內生真菌E.chisosa是由北美洲E.amarillans、亞歐大陸的E.bromicola和E.typhina3種有性態內生真菌雜交形成，而睡眠草感染的內生真菌E.funkii是由北美洲E.elymi和E.festucae雜交形成。本研究中，紫花針茅所感染的內生真菌用tubB和tefA兩種管家基因擴增序列與針茅族和其他Epichloё屬內生真菌序列構建系統發育樹，發現sp2、sp19和sp27、sp41分別與豎針茅分離內生真菌擴增所得不同拷貝基因序列形成明顯兩個分支，且與豎針茅雜交親本E.typhina和E.bromicola形成較好的拓撲結構；而其他4個菌株所得序列與醉馬草分離的E.gansuensis組成另外一個分支(圖2b，c)。可見，紫花針茅感染的內生真菌與宿主間未呈現嚴格特異性，表明紫花針茅可能成為不同內生真菌的宿主潛力較高。這一現象在其他冷季型禾草分離不同類型內生真菌的研究結果中也得到證實，例如，Moon等[52]從南美洲刺猬草(Echinopogonovatus)體內分離出兩種Epichloё內生真菌，其中從新西蘭和澳大利亞分離出無性態(Neotyphodium)內生真菌，而從澳大利亞分離的內生真菌是由E.festucae和E.typhina雜交而成的有性態內生真菌(Epichloё)。同時，中國西部分布的醉馬草感染的內生真菌也存在差異，雖然兩種內生真菌均是無性態內生真菌，但在菌落、分生孢子形態和基因組組成等方面存在明顯差異[45-46]；Zhang等[53]研究也發現內蒙古草地主要優勢禾草——羽茅同時感染E.sibiricum和E.gansuense兩種內生真菌。另外，同一種Epichloё屬內生真菌可能感染不同寄主的觀點也從側面證實上述的觀點。例如，Craven等[38]針對E.typhina內生真菌和宿主范圍進行分析，發現能從早熟禾亞科的黑麥草屬(Lolium)、早熟禾屬(Poa)、梯牧草屬(Phleum)、短柄草屬(Brachypodium)、黃花茅屬(Anthoxanthum)、鴨茅屬(Dactylis)和偃麥草屬(Elytrigia)的10余種植物中分離到這種內生真菌；然而，相對于大多數有性態禾草內生真菌與宿主之間還是保持高度的特異性。主要原因可能： 1)紫花針茅內生真菌基因組保持較高的變異位點，可能導致紫花針茅內生真菌存在較高的基因多樣性。根據Zhang等[53]研究結果，羽茅中分離的E.gansuensis較E.sibiricum具有更高的基因多樣性，同時發現約13%內生真菌存在雜合體，揭示不同羽茅內生真菌種群間可能存在雜交現象。本研究中紫花針茅在tubB和tefA引物擴增時，出現3個不同分支，由于未開展基因多樣性等有關的研究，所以關于其是否雜交而來還有待進一步證實； 2)內生真菌和宿主進化時間可能存在差異，即在宿主分化之前，內生真菌已經完成分化，最終造成同一宿主可能感染不同內生真菌[52]，Hamasha等[54]研究表明青藏高原和約旦地區的紫花針茅個體基因組間存在較大差異，這與其他歐洲大陸針茅族物種保持相對較低的基因個體差異不一致[55]；同時，Bieniek和Pokorny[56]根據針茅屬植物穎果和花粉化石資料推算，針茅族地理起源的中心位于歐洲中部，并以歐洲中部為原點向周邊大陸遷移，可以從側面證實紫花針茅能與北美地區的豎針茅感染同種類型的內生真菌。3)一般無性態內生真菌是由不同的有性態內生真菌雜交形成而來[41,44,53,57-58]，根據Zhang等[53]對中國內蒙古地區羽茅感染內生真菌多樣性分析，雖然羽茅中部分內生真菌存在雜交的潛力，但基因漂流被嚴重阻礙，主要以無性態內生真菌存在。本研究紫花針茅擴增時條帶單一，可能與基因流嚴格抑制有關。

值得注意的是在構建actG系統發育樹時， sp2、sp19、sp27和sp41與豎針茅單拷貝actG序列很好的組成一枝，而且與E.bromicola形成了較好的親緣關系。而這與在tefA和tubB中形成明顯的兩個分支形成差異(圖2)，原因可能是引物擴增的位點出現分化，導致形成假陰性擴增，這一研究結果與Moon[44]對針茅族和臭草族內生真菌起源研究中得到的結論一致。

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Isolation and identification of endophytes infectingStipapurpurea, a dominant grass in meadows of the Qinghai-Tibet Plateau

BAO Gen-Sheng1,2, LI Chun-Jie1*

1.StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro-ecosystems,CollegeofPastoralAgricultureScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China; 2.AcademyofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,QinghaiUniversity,Xining810016,China

Abstract:Stipa purpurea is a dominant grass species in alpine grassland of the Qinghai-Tibet Plateau. Research on this species to date has focused on defining genetic diversity, community classification, ecological function, physiological traits and grassland community characteristics; however, isolation and identification of endophyte fungi from S. purpurea has seldom been attempted. Endophyte was isolated from S. purpurea by leaf surface sterilization and axenic culture, and hyphae, colony physical characteristics, and conidial morphology were observed. Endophyte nucleotide sequences were cloned by tubB, tefA, and actG specific primers, and representative endophyte sequences were downloaded from Genbank to determine homology. A maximum likelihood method was applied to construct a phylogenetic tree. It was found that endophyte occurrence in S. purpurea was relatively high in Qinghai province, compared to other sites. Colony morphology characteristics, growth speed and morphology of conidia were identical to those of Epichloё spp. The results of tubB and tefA phylogeny indicated that four endophyte strains isolated from S. purpurea were most closely related to Epichloё chisosa from North American Achnatherum eminens and formed two distinct branches. Four other endophyte strains isolated from S. purpurea were most closely related to Epichloё indbrians and Epichloё gansuensis, which infect Achnatherum inebrians and these strains formed another distinct branch. In addition, analysis of actG phylogeny indicated that four clarify further endophyte strains isolated from S. purpurea were also most closely related to Epichloё chisosa from North American A. eminens and formed another distinct branch. Other endophyte strains isolated were most closely related to Epichloё gansuensis from China (Xinjiang) and formed another distinct branch. Our results suggest that the host-specificity might not occur in endophytes infecting S. purpurea and S. purpurea appears to be infected by various Epichloё species.

Key words:Qinghai-Tibet Plateau; Stipa purpurea; Epichloё; phylogeny; host

*通信作者

Corresponding author. E-mail:chunjie@lzu.edu.cn

作者簡介：鮑根生(1980-)，男，青海樂都人，助理研究員，在讀博士。E-mail:baogensheng2008@hotmail.com

基金項目：國家973計劃課題(2014CB138702),國家自然科學基金項目(31372366), 教育部創新團隊發展計劃項目(IRT13019)和公益性行業(農業)科研專項經費項目(201203041)資助。

收稿日期：2015-04-23；改回日期：2015-07-17

DOI：10.11686/cyxb2015214

http://cyxb.lzu.edu.cn

鮑根生，李春杰. 青藏高原高寒草地優勢禾草-紫花針茅內生真菌分離和鑒定. 草業學報, 2016, 25(3): 32-42.

BAO Gen-Sheng, LI Chun-Jie. Isolation and identification of endophytes infectingStipapurpurea, a dominant grass in meadows of the Qinghai-Tibet Plateau. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(3): 32-42.