阿壩地區狼毒內生放線菌多樣性及抗菌活性

廖敏，張波，范中菡，陳熊春蕊，張小平*

(1.四川農業大學資源學院，四川 成都 611130；2.綿陽師范學院生命科學與技術學院，四川 綿陽 621000)

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阿壩地區狼毒內生放線菌多樣性及抗菌活性

廖敏1,2，張波1，范中菡1，陳熊春蕊1，張小平1*

(1.四川農業大學資源學院，四川 成都 611130；2.綿陽師范學院生命科學與技術學院，四川 綿陽 621000)

摘要：通過可培養方法以四川省阿壩地區藥用植物狼毒為研究對象，探究其內生放線菌多樣性及抗菌活性，為開發新型生物活性物質提供依據。結果如下，1)多種因素決定了狼毒內生放線菌分離數量，其中土壤有機質與其相關系數為0.86，在0.05水平相關性顯著。2)高氏一號培養基分離52株內生放線菌，占總數30.4%；植株不同部位分離內生放線菌結果為根部>莖部>葉部>花部。3)16S rDNA-RFLP將供試菌株分成11個遺傳群，代表菌株系統發育分析表明，供試菌株以鏈霉菌屬為主，其余菌株包括諾卡氏菌屬、北里孢菌屬、克里布所菌屬。4)對代表菌株NRPS、PKS基因分析共獲得4個PKS基因和2個NRPS基因；大部分代表菌株對3種病原真菌有抗菌活性，菌株SCAUEⅢD11-1效果最好。綜上，狼毒內生放線菌分離結果受多因素影響，具有較豐富的多樣性；功能基因篩選及抗菌活性結果揭示出阿壩地區狼毒內生放線菌具有潛在的運用價值。

關鍵詞：狼毒；內生放線菌；多樣性；功能基因；抗菌活性；系統發育

狼毒(Stellerachamaejasme)是一種多年生草本植物，有逐水祛痰、破積殺蟲之用，臨床可用于治療水腫腹脹，慢性氣管炎等[1]。四川省阿壩地區以高原和山谷為主，資源優勢明顯，作為藥材資源之一的狼毒，在該區域的分布也較為廣泛。近幾年隨著人們對狼毒藥用價值的開發與利用，對其進行的研究也越來越多。莊果等[2]采用不同方法和溫度制備炮制品研究輔料和溫度對狼毒成分的影響，結果表明輔料和溫度對狼毒成分的影響都較大；王燦堅等[3]采用RP- HPLC法測定狼毒中狼毒乙素和巖大戟內酯B的含量發現該方法可用于狼毒藥材的質量控制。目前，大多有關狼毒的研究主要停留于對其內在成分的測定與發掘，其微環境的探究基本沒有涉及。

內生放線菌是植物微生態系統重要組成部分，藥用植物內生放線菌多樣性豐富，能產生天然活性物質[4]。研究內生放線菌群落結構，挖掘其功能基因及抗菌活性已逐漸成為從資源到實踐的必要途徑。張波等[5]運用變性梯度凝膠電泳分析了花苜蓿(Medicagoruthenica)內生放線菌的多樣性和群落結構；姚曉玲等[6]對喜樹(Camptothecaacuminata)種子內生放線菌進行分離鑒定，并從中篩選到新型活性化合物產生菌，能為發掘新活性化合物提供有價值的實驗材料。Zhao等[7]對攀西高原藥用植物內生放線菌功能基因及抗菌活性研究表明，分離的內生放線菌抗菌活性與PKS、NRPS功能基因擴增結果有一定聯系，且表現出廣譜抗菌活性，蘊含潛在價值的天然活性物質。本文以采自四川省阿壩地區藥用植物狼毒分離的內生放線菌作為研究對象，探究其種群多樣性、系統發育、功能基因及抗菌活性，為獲取有價值野生藥用植物內生放線菌資源提供依據。

1材料與方法

1.1實驗材料

本研究于2013年6月中旬從四川省阿壩地區6個不同地點采集狼毒植株樣品。每個采樣點采集3株健康植株，植株相距5～10 m，并采集適量根際土，植株生長海拔及具體地理位置見表1。為防止樣品污染，采集后對樣品進行簡單處理：首先去除植株根表土壤，然后乙醇擦拭植株有切口部位并對切口進行蠟封。將處理后的樣品裝入無菌塑料袋，帶回四川農業大學微生物實驗室進行放線菌分離。根際土風干后進行理化性質測定[8]，結果見表2。

表1　采集狼毒樣品的地理情況

1.2內生放線菌分離

選擇5種培養基用于狼毒內生放線菌分離，所用瓊脂量均為1.8%。5種培養基分別為：Ⅰ、精氨酸培養基(精氨酸1 g，ZnSO40.001 g，甘油12.5 g，MnSO40.001 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，CuSO40.001 g，K2HPO41 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 L，pH=7.2)；Ⅱ、克氏合成1號培養基(K2HPO41 g，MgCO30.3 g，NaCl 0.2 g，KNO31 g，FeSO40.01 g，CaCO30.5 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 L，pH=7.2～7.4)；Ⅲ、改良脯氨酸培養基(脯氨酸5 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 L)；Ⅳ、腐植酸培養基(腐植酸1 g，NaOH 1 g，Na2HPO40.5 g，KCl 1.7 g，MgSO40.05 g，FeSO40.01 g，CaCl21 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 L)；Ⅴ、高氏一號培養基(可溶性淀粉20 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，K2HPO40.5 g，NaCl 0.5 g，KNO31 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 L)。為了抑制真菌和細菌生長，使用終濃度為50 μg/mL的抑菌劑：萘啶酮酸和K2Cr2O7。

表2　土樣基本理化性質

將樣品根莖葉花分離后，用0.1% Tween 20清洗30 s，無菌水沖洗3次；75%乙醇浸泡5 min，無菌水沖洗3次；2% NaClO2浸泡5 min，無菌水沖洗3次；10% NaHCO3漂洗10 min[9]。樣品處理后置于鋪有無菌濾紙的無菌培養皿，吸干植物組織表面水分。同時取最后一次清洗樣品的無菌水300 μL均勻涂布于5種培養基，28℃培養30 d，觀察有無菌落長出以驗證分離放線菌為內生。搗碎樣品并均勻涂布于培養基，28℃培養30 d。分離純化培養基采用ISP4[可溶性淀粉10 g，(NH4)2SO44 g，CaCO32 g，MgSO42 g，K2HPO42 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 L，pH=7.0～7.5]。實驗分離所得內生放線菌統一編碼為SCAUE(四川農業大學內生放線菌)&培養基編號&植物編號&植株部位&菌株自然序號。其中植株部位根、莖、葉、花分別用r、s、l和f表示。

1.316S rDNA RFLP分析

放線菌提取DNA使用細菌基因組DNA提取試劑盒(購自上海生工)，PCR擴增采用引物為8-27f(5′-CCGTCGACGAGCTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)[10]和 1523-1504r(5′-CCCGGGTACCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)[10]。反應體系(50 μL)：master Mix (購自上海生工)25 μL，引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補足50 μL。PCR程序[11]：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸2 min，變性到延伸循環30次，72℃延伸10 min，最后4℃保存。完成PCR后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳100 V，15 min。

選用限制性內切酶HaeⅢ和HhaⅠ對PCR產物進行酶切，反應體系(10 μL)：10×Buffer 1 μL，內切酶(10 U/μL)各0.5 μL，PCR產物 5 μL，ddH2O補足至10 μL。該體系充分混勻后，37℃ 8～16 h反應，之后使用2.5%瓊脂糖凝膠，100 V水平電泳4 h。電泳完成后成像儀照相并保存。采用Excel、NTSYS等軟件對酶切圖譜進行分析處理，運用非加權平均法(UPGMA)進行聚類分析并構建樹狀圖譜[12]。

1.4功能基因擴增

PKSI擴增引物為PKS-I-A(5′-GCSATGGAYCCSCARCARCGSVT-3′)、PKS-I-B(5′-GTSCCSGTSCCRTGSSCYTCSAC-3′)；PKSII擴增引物為PKS-II-A(5′-TSGCSTGCTTGGAYGCSATC-3′)、PKS-II-B(5′-TGGAANCCGCCGAABCCGCT-3′)；NRPS擴增引物為NRPS-A(5′-GCSTACSYSATSTACACSTCSGG-3′)、NRPS-B(5′-SASGTCVCCSGTSCGCTAS-3′)[7]。PKS及NRPS擴增：1)反應體系(30 μL)：15 μL 2×PCR Mix，1 μLPKS-I-A/PKS-I-B(10 pmol)或PKS-II-A/PKS-II-B(10 pmol)或NRPS-A/NRPS-B(10 pmol)，2 μL DNA，無菌水補足至30 μL[7]。2)反應程序：94℃預變性5 min(NRPS為4 min)，94℃變性1 min(NRPS為30 s)，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環，72℃延伸10 min，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物大小[13]。

1.5抗菌活性檢測

選取11株狼毒內生放線菌采用對峙生長法進行抗菌活性檢測[14]，病原真菌包括：西瓜枯萎病原真菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、黃瓜炭疽病原真菌瓜類刺盤孢菌(Colletotrichumorbiculare)和玉米彎孢病原真菌月狀彎孢菌(Curvularialunata)，3種植物致病真菌均由四川農業大學植物病理實驗室提供。

1.6菌株測序及構建系統發育樹

通過限制性酶切多態分析，選擇代表菌株進行測序。測序結果用Blast程序從GenBank公共數據庫中獲得相似性較高相關菌株16S rDNA基因序列。采用Clustal X軟件進行多序列比對，結合Neighbor-joining方法在Mega 5.0中構建系統發育樹[15-16]。

2結果與分析

2.1各因素對狼毒內生放線菌分離的影響

圖1　不同培養基及植株不同部位分離內生放線菌數量比較Fig.1　Comparison of isolated endophytic actionbacteria with different culture media in different plant tissues

研究結果表明，采樣地海拔、土壤有機質、土壤pH與土壤水分都不同程度影響狼毒內生放線菌的分離結果。其中，采樣地海拔與土壤pH對內生放線菌分離數量呈不顯著負相關，而土壤水分與土壤有機質對其呈正相關，后者相關系數為0.86，在0.05水平相關性顯著。

5種培養基對狼毒內生放線菌分離情況差異較大。圖1顯示，高氏一號培養基分離到52株內生放線菌，占總數30.4%，而精氨酸培養基分離放線菌數量最少，僅占總數9.9%。植株不同部位分離內生放線菌差異也較大，狼毒根、莖、葉、花都分離到內生放線菌，根部分離數量最多，占總數40.4%，莖部其次，花部最少，分離到12株。

2.2狼毒內生放線菌RFLP分析

通過形態鑒定從171株狼毒內生放線菌中篩選37株進行酶切聚類。HhaⅠ/HaeⅢ酶切綜合聚類如圖2所示，供試菌株在67%相似度水平聚在一起，在82%相似度水平可分為 11個遺傳類型。其中1，2遺傳類型占主導地位，分別包含9和14株內生放線菌，合計占總數62.2%。1遺傳類型內生放線菌主要分離自腐植酸培養基，來源于狼毒的根、莖、葉、花；而2遺傳類型內生放線菌50%分離自高氏一號，71.4%來源于狼毒根部。

2.3功能基因及抗菌活性分析

11株代表菌株共得到4個PKS基因片段，占總數36.3%，而NPRS基因片段只有2個，占18.2%。4個PKS基因中1個為PKSⅡ，3個為PKSⅠ，PKSⅠ基因條帶在1400 bp左右(圖3)，而PKSⅡ與NRPS基因片段大小相似,約為750 bp。結合系統發育分析，具有功能基因的菌株主要為鏈霉菌屬(Streptomyces)與克里布所菌屬(Kribbella)。

對11株代表菌株的抗菌活性測定顯示，90.9%對病原真菌有不同程度抑制(表3)，體現較廣的抗菌譜。抗菌圈測定結果表明不同內生放線菌對不同病原真菌拮抗效果存在差異，對西瓜枯萎病原真菌(F.oxysporum)、玉米彎孢病原真菌有抑制效果的菌株皆占總數63.6%，而抑制黃瓜炭疽病原真菌的放線菌僅3株。另外，菌株SCAUEⅢD1l-1對3種病原真菌都有抑制效果，抑菌率達100%，而菌株SCAUEⅢA1l-1抑菌率為0。

2.4狼毒內生放線菌系統發育

圖2　內生放線菌HaeⅢ/HhaⅠ酶切綜合聚類圖Fig.2　Integrated clustering diagram for HaeⅢ/HhaⅠdigestion of endophytic actionbacteria　聚類圖中編號1、2為主要遺傳類型群，HhaⅠ與HaeⅢ為2種限制性內切酶，下方為酶切圖譜。The major genetic types in the clustering diagram were numbered 1 and 2. HhaⅠand HaeⅢ were restricted enzymes used in the study, and below were restriction patterns.

從11 個遺傳類群各選取1株代表菌株進行測序，系統發育分析發現，11株內生放線菌大致聚為4簇(圖4)。供試菌株包括鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬(Nocardia)、克里布所菌屬和北里孢菌屬(Kitasatospora)。其中，鏈霉菌屬為明顯優勢種屬，占63.6%。結合RFLP 聚類及系統發育分析，狼毒內生放線菌具有較豐富的多樣性，SCAUEⅢA1r-1與SCAUEⅢA1l-1為北里孢菌屬，明顯遠離其他菌屬放線菌。

圖3　代表菌株 PKSⅠ擴增電泳圖Fig.3　Electrophoretogram of PKSⅠamplication of representative strains　M:Marker; a，b，c:擴增產物Amplification products.

3討論

采樣地海拔、土壤有機質、土壤pH與土壤水分會影響內生放線菌分離數量[17-18]。各因子間存在必然關系：海拔不僅反映采樣地垂直高度變化，還影響其他因子的變動。海拔越高，溫度越低，植被覆蓋率減小，因此土壤質地發生變化；土壤質地將影響土壤有機質、土壤pH與土壤水分等因子。本研究除土壤有機質與內生放線菌分離數量呈顯著正相關，其余因子與內生放線菌分離數量相關性不顯著。土壤有機質能為微生物生長繁殖提供適宜條件， 豐富的有機質很大程度上增加微生物的數量[19]。土壤水分較高的環境更吸引微生物進入， 從而增加微生物的數量，盡管這與本研究結果一致，但相關系數不到0.1。而海拔與土壤pH對菌株分離數量呈不顯著負相關。海拔作為放線菌分離影響因素之一，較大程度影響著分離結果，土壤pH亦然，可本研究中二者與內生放線菌分離數量相關系數R都較小。傳統培養方法盡管能分離獲得一些放線菌，但因其不能完全模擬植物內生環境[20]而導致分離結果與實際存在偏差，可培養手段分離的放線菌并不能準確反映自然環境下放線菌生長情況，因此R值偏小。從高海拔、土壤偏酸或偏堿環境下生長的植株組織分離的放線菌數量相對較少，但此環境往往可能分離到稀有菌株，甚至新種。因此，為更多分離出內生放線菌，可選用多種培養基模擬內生放線菌的自然生長環境[21]。

內生放線菌不僅受植株生長區域的影響，還受培養環境、組織類型等因素影響。本研究根據培養基化學成分的差異選擇了5種培養基，統計發現，不同培養基分離所得放線菌數量差異較大。高氏一號培養基，配方簡單，卻分離到較多放線菌，而精氨酸培養基化學成分最豐富，還含有Zn2+、Mn2+等微量元素，分離效果最差。綜合分析表明，生長于營養豐富培養基的放線菌生命力可能不如寡營養培養基生長的放線菌。在不斷分離純化菌株過程中，一些放線菌由于不能適應驟變的生長環境而死亡[22-23]。植物內生放線菌具有穩定的生存空間，能在植物體內生存繁殖，普遍分布于植物根、莖、葉等器官或組織。相關研究表明，植物內生放線菌在不同器官或組織的分布存在明顯差異。本研究中，狼毒內生放線菌分布特點為：根>莖>葉>花，結果與趙珂等[24]的研究一致。而田新莉等[25]對87種中草藥內生放線菌的研究卻發現地上部分離內生放線菌明顯多于地下部。可見內生放線菌在植物體內的分布并不固定，會隨外界或自身一些條件改變而變化，這種變化可能基于某些發生機制[26]。

表3　狼毒內生放線菌代表菌株抗菌活性

注： +++為抑菌圈>10 mm; ++為5～10 mm; +為1～5 mm；-表示無抑制作用。

Note: +++,width of growth inhibition zone >10 mm; ++,5～10 mm; +,1～5 mm；-,without inhibition.

圖4　狼毒內生放線菌代表菌株系統發育分析Fig.4　Phylogenetic analysis of representive endophytic actinomycetes in S. chamaejasme　Streptomyces：鏈霉菌屬；Nocardia：諾卡氏菌屬；Kribbella：克里布所菌屬；Kitasatospora：北里孢菌屬；Morchella：外緣真菌羊肚菌屬；括號內序號為菌株登錄號。The serial numbers in the brackets were accession numbers of the strains.

放線菌中鏈霉菌屬是各種天然產物的重要來源，可產生豐富代謝物[27]。抗菌活性研究顯示，抑制效果明顯的代表菌株70%為鏈霉菌屬。狼毒內生放線菌對不同病原真菌抑制程度不同，可見這些放線菌產生抑制病原真菌的化合物較為豐富，而非單一[28]。結合功能基因與抗菌活性研究不難發現，擴增出功能基因片段的菌株對病原真菌都有抑制效果，SCAUEⅣA2f-1對玉米彎孢病原菌抑菌圈直徑大于10 mm；而SCAUEⅢD1l-1未擴增出功能基因片段，卻對3種病原真菌皆有明顯抑制，可見功能基因與抗菌活性并非絕對關系。這與Zhao等[7]研究發現一致，可能是由于抗菌活性物質并非PKS與NRPS基因合成，或者說某些功能基因合成的化合物并不作用于病原真菌。

采用多種酶切對放線菌DNA進行切割，結果存在差異。相關研究表明采用兩種不同限制性內切酶對放線菌DNA進行研究，可實現屬一級的鑒定水平[29]。本研究綜合HhaⅠ/HaeⅢ效果較好，減少DNA呈現的片段重復性，增強其特異性[30]。11株代表菌株系統發育分析，63.6%為鏈霉菌屬，可見鏈霉菌屬在放線菌中的絕對優勢。鏈霉菌可產生有價值的次生代謝產物，如鏈霉素[31-32]，這些生物活性物質經開發可廣泛運用于醫學。同時，狼毒內生放線菌中還包括諾卡氏菌屬等，有較為廣闊的研究前景，揭示出狼毒內生放線菌資源的豐富性。

4結論

初步研究發現，狼毒內生放線菌群落結構受多因素影響，包括土壤有機質、土壤水分、海拔及土壤pH，其中土壤有機質與內生放線菌分離數量呈顯著正相關。分離培養基的選擇及植株分離部位都會影響內生放線菌的分離結果：寡營養型培養基優于富營養型培養基，植株不同分離部位而言，根部分離內生放線菌數量最多，花部最少。綜合RFLP 聚類圖及系統發育樹，狼毒內生放線菌可分為11組遺傳群，多樣性較豐富，測序結果顯示鏈霉菌屬為優勢菌群。代表菌株功能基因及抗菌活性研究表明，小部分放線菌存在PKS和NRPS基因片段，11株放線菌有較廣的抗菌譜，但功能基因與抗菌活性無必然關聯。綜上可見，狼毒在阿壩地區生長較為普遍，對其內生放線菌的探索對今后開發新型生物活性物質有較為積極地影響與借鑒。

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Diversity and anti-microbial activity of endophytic actinomycetes isolated fromStellerachamaejasmesampled in Aba, Sichuan

LIAO Min1,2, ZHANG Bo1, FAN Zhong-Han1, CHEN XIONG Chun-Rui1, ZHANG Xiao-Ping1*

1.DepartmentofMicrobiology,CollegeofResources,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China；2.CollegeofLifeScienceandBiotechnology,MianyangNormalUniversity,Mianyang621000,China

Abstract:In order to develop new biologically active substances in medicinal plants, an isolation and culture method was employed to investigate the taxonomic diversity and anti-microbial activities of endophytic actinomycetes isolated from Stellera chamaejasme sampled in Aba, Sichuan. It was found that the number of isolates was affected by many factors, especially organic matter content which was significantly positively correlated with the isolate number (P<0.05, r=0.86). Fifty two isolates were obtained on Gauze No.1 growth medium, accounting for 30.4% of total isolations. The numbers of isolates decreased in the following order: root, stem, leaf and flower. Analysis using 16S rDNA-RFLP divided these isolated strains into 11 clusters and further phylogenic analysis classified representative strains as genera Streptomyces, Nocardia, Kitasatospora and Kribbella, respectively, with Streptomyces being predominant. PKS (4) and NRPS (2) genes were detected in the study and most of representative strains had antibiotic activity towards the pathogenic fungal strains, with SCAUEⅢD11-1 being most potent. It is concluded that behavior of isolates of endophytic actinomycetes from S. chamaejasme is affected by many factors with resulting diversity of expression. Functional genes and antibiotic activity indicated endophytic actinomycetes from S. chamaejasme sampled in Aba had potential medicinal value.

Key words:Stellera chamaejasme; endophytic actinomycetes; diversity; functional genes; antibiotic activity; phylogenetic analysis

*通信作者

Corresponding author. E-mail:zhangxiaopingphd@126.com

作者簡介：廖敏(1979-)，女，四川綿陽人，在讀博士。 E-mail: esweetlm@163.com

基金項目：國家 863 計劃(2013AA102802-05)資助。

收稿日期：2015-05-19；改回日期：2015-08-25

DOI：10.11686/cyxb2015262

http://cyxb.lzu.edu.cn

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LIAO Min, ZHANG Bo, FAN Zhong-Han, CHEN XIONG Chun-Rui, ZHANG Xiao-Ping. Diversity and anti-microbial activity of endophytic actinomycetes isolated fromStellerachamaejasmesampled in Aba, Sichuan. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(3): 43-51.