纖維素降解細菌的篩選、生物學特性及降解效果

賈輝，陳秀蓉*，蘆光新，孔雅麗，楊成德

(1.甘肅農業大學草業學院，草業生態系統重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.青海大學農牧學院草業科學系,青海 西寧 810016)

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纖維素降解細菌的篩選、生物學特性及降解效果

賈輝1，陳秀蓉1*，蘆光新2*，孔雅麗1，楊成德1

(1.甘肅農業大學草業學院，草業生態系統重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.青海大學農牧學院草業科學系,青海 西寧 810016)

摘要：為了從東祁連山高寒草甸土壤中分離篩選纖維素分解細菌，本研究根據在羧甲基纖維素鈉培養基和濾紙平板培養基上的生長情況，初步篩選出3株具有較強纖維素分解能力的細菌，并對其生長條件進行了初步研究，結果表明，3株菌的最適生長溫度范圍為25～30℃；最適生長pH因菌種不同位于5～8之間；最適生長鹽濃度位于4%～5%。菌株X1-2具有較好降解特性，根據形態觀察、革蘭氏染色及16S rRNA系統發育比較，鑒定該菌為芽孢桿菌(Bacillus sp.)，是一株十分具有開發生產纖維素酶能力的菌株。

關鍵詞：纖維素分解菌；篩選；生物學特性；降解效果

纖維素是葡萄糖殘基以β-1,4-糖苷鍵連接而形成的線性葡聚糖，是一種廣泛存在于植物中的骨架多糖[1-2]。纖維素豐富的糖源可以用于許多原料加工工業。遺憾的是許多纖維素廢棄物通常被燃燒處理掉，這是一個普遍存在于發展中國家甚至是全球的浪費現象[3-4]，由此形成的環境污染問題和資源浪費都已經相當嚴重。因此，研發大規模、工業化和經濟節約的天然纖維素資源化轉化技術是擺在當今世界的一大課題。利用微生物分解轉化纖維素類物質可以將其變為飼料、栽培基質、有機肥料、化工原料等[5-7]。纖維素酶是纖維素降解過程中的重要酶類物質，包括3類可溶性細胞外的酶：1,4-β-內切葡聚糖酶，1,4-β-外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。許多微生物包括許多細菌、真菌和放線菌都有產纖維素酶的能力。自然界中具有纖維素分解能力的菌株很多，例如：梭狀芽孢桿菌、球毛殼菌、木霉、青霉屬、曲霉、擔子菌、蟲擬蠟菌、木腐菌和青霉菌等[8-10]。但目前獲得的菌株其纖維素酶活力普遍較低[11-13]，即使酶活力很高的菌株繼代培養后表現出退化或不穩定，這些因素一直是阻礙纖維素酶大規模生產應用的瓶頸問題[14-17]。篩選高效纖維素酶活力的菌株仍然是人們努力的目標[18-19]。東祁連山高寒草甸金槍河流域，植物群落多樣性復雜，微生物資源豐富，本研究擬從該地區土壤中篩選高產纖維素分解細菌，通過對其纖維素降解能力和生物學特性測定，旨在獲得能夠高效、快速降解纖維素的優良菌種。

1材料與方法

1.1材料

2013年5月土樣采集自祁連山高寒草甸甘肅省天祝縣金槍河地區。主要供試培養基有以下幾種：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)平板培養基：NaNO32 g、K2HPO41 g、KCl 0.5 g、MgSO40.5 g、FeSO40.01 g、CMC-Na 10 g、瓊脂10 g、蒸餾水1000 mL。濾紙平板培養基：NaNO32.5 g、KH2PO41 g、 CaCl2·6H2O 0.1 g、 MgSO40.3 g、NaCl 0.1 g、FeCl30.01 g、濾紙條10 g、蒸餾水1000 mL、無菌濾紙、pH自然。牛肉膏蛋白胨(NA)培養基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、瓊脂8 g。NB培養基：牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、葡萄糖2.5 g。

1.2方法

1.2.1具有降解纖維素能力的細菌分離稱取各樣10 g加入90 mL無菌水，將樣品振蕩10～15 min，使土壤顆粒均勻分散成為懸液，靜置數分鐘，吸取1 mL土懸液到9 mL稀釋液中，依次按10倍法稀釋，通常稀釋到10-4成一系列稀釋液。取1 mL土懸液接種于羧甲基纖維素鈉平板培養基上，用玻璃刮刀使其均勻涂抹于培養基表面，每稀釋度設3個重復，在28～30℃溫箱中培養，待菌落長成后，按菌落特征歸類和編號，然后將菌落特征不同的細菌轉入NA斜面培養基培養，純化后保存備用。

1.2.2供試細菌分解纖維素能力的測定對CMC-Na分解能力的測定:挑取分離的細菌菌落接到CMC-Na平板培養基上，于25℃避光培養7 d，采用剛果紅染色，記錄各菌株的透明圈大小。

對濾紙分解能力的測定:將分離得到的具有纖維素分解能力的菌株，接入NB培養基中20℃搖床培養5 d后制成菌懸液，于盛有50 mL液體培養基的150 mL三角瓶中放入2.6 cm×6.2 cm的濾紙條，接入1 mL菌液100 r/mim進行恒溫振蕩培養8 d，以濾紙條的斷裂程度評價降解效果。

對中華羊茅(Festucasinensis)凋落物分解能力的測定:稱取5 g中華羊茅凋落物，放入盛有100 mL液體培養基的250 mL三角瓶中，然后接入1 mL菌液，100 r/mim進行恒溫振蕩培養15 d后取出，烘干稱重，按下列公式計算中華羊茅的減重百分比，確定菌種分解中華羊茅凋落物的能力。

W=(S-S1)/S×100%

式中，W代表中華羊茅凋落物分解百分比，S代表中華羊茅凋落物的原始干重，S1為中華羊茅凋落物溶解后的烘干量。

1.2.3纖維素降解菌的生長條件測定最佳生長溫度的測定：將復選出的菌種接于細菌液體培養基，分別置于5,10,15,20,25,30,35,40,45℃等9個溫度下懸浮培養，每處理3 次重復，3 d后測定菌液的OD600值，并根據OD600值的大小判斷不同溫度條件下菌體的生長狀況，確定其最適生長溫度。

最佳生長酸堿度的測定：pH值分別用4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0磷酸緩沖液配制成11個濃度，置于上述所測最適溫度下培養，每處理3 次重復。3 d后測定菌液的OD600值，并根據OD600值的大小判斷不同pH條件下菌體的生長狀況，確定其生長的最適pH值。

耐鹽能力的測定：在28℃條件下，將NA培養液中NaCl含量分別調到0.5%,1.0%,1.5%,2.0%,2.5%,3.0%,3.5%,4.0%,5.0%,6.0%,7.0%,8.0%和9.0%，然后接入菌體。48～72 h后取出用分光光度計進行測定，記錄OD600數值。

1.2.4菌株的分子生物學鑒定引物設計：根據16S rDNA兩端的保守序列，設計1對細菌的通用引物。引物1序列：5′-CCGGATCCAGAGTTTGATCATGGCTCAGCA-3′；引物2序列：5′-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，由上海生物工程技術有限公司合成。

菌株DNA 的提取和純化：采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，16S rRNA基因的擴增按文獻[9]進行。

系統發育分析：將純化PCR產物送至上海Sangon生物技術公司測序，并將獲得的序列與NCBI數據庫中已報道的與該序列相似性較高的典型菌株的序列進行同源性比較。采用Clustal 1.8軟件進行多序列比對，再用 MEGA 4.1中的Neighbor-joining (NJ)方法構建系統發育樹，用Bootstrap對系統樹進行統計檢驗，確定菌株的系統發育學地位。

1.3數據處理

所得數據用SPSS 17.0軟件進行處理和分析，并用Excel軟件作圖。

2結果與分析

2.1菌種形態特征

將初次分離的8株細菌接在NA培養基上培養3 d后，對菌落形態特征進行描述(表1)。

表1　菌落培養特征描述

2.2纖維素分解能力的測定

2.2.1菌種分解CMC-Na能力測定將8株分離獲得的具有纖維素分解能力的細菌，根據水解圈直徑(D2)與菌落直徑(D1)的比值可以看出，菌株X1-2分解纖維素的能力最強，X1-1和X2次之，X5的纖維素分解能力最弱(表2)。

2.2.2濾紙崩解試驗對獲得的8株纖維素分解細菌進行搖瓶濾紙崩解試驗，探究其纖維素分解能力，在15 d的濾紙崩解試驗中，有3株細菌表現出明顯的濾紙降解效果(圖1)，其菌株X1-1、X1-2和X2中濾紙基本完全崩解，搖瓶中的液體處于半清狀，表明該3株細菌對濾紙具有明顯的分解能力。

2.2.3中華羊茅分解定量測定根據獲得的菌株在CMC-Na平板上的生長情況和水解結果，以及濾紙的崩解試驗結果，選擇3株細菌X1-1、X1-2和X2進一步研究它們對中華羊茅纖維素的分解效果。對3株細菌分別培養5,10,15 d后的中華羊茅重量變化情況進行了測定，結果見圖2和表3。

表2　纖維素分解菌株的CMC-Na分解能力測定

D1:菌落直徑 Diameter of the colony;D2: 水解圈直徑Hydrolysis circle diameter.

圖1　培養15 d后菌株對濾紙的崩解效果Fig.1　Disintegration of filter paper with isolates after culturing for 15 days

圖2　培養15 d后菌株對中華羊茅的分解效果Fig.2　Disintegration of F. sinensis with isolates after culturing for 15 days

項目Item時間Time(d)5X1-1X1-2X210X1-1X1-2X215X1-1X1-2X2CK5.005.005.005.005.005.005.005.005.00殘余質量Residualmass(g)4.524.314.483.863.253.973.122.243.36分解率Resolutionratio(%)9.813.911.322.835.026.336.255.432.8

培養5 d后，3株細菌對中華羊茅纖維素都有所分解，但差異性不顯著，其中中華羊茅的分解率分別為9.8%，13.9%和11.3%。培養10 d后3株菌株對中華羊茅的分解率都有了顯著的增加，分別為22.8%，35.0%和26.3%，尤其是菌株X1-2降解中華羊茅纖維素的能力最高，繼續培養至15 d后菌株X1-2使得中華羊茅的分解率達到了55.4%，分解效果明顯。

2.3菌株生物學特性測定

2.3.1溫度對菌體生長的影響試驗結果表明，接菌培養3 d后，3種菌在15～45℃均能夠生長。X1-1最適生長溫度為25℃，在30和35℃均生長良好，與25℃相比差異顯著(P<0.05)，低于25℃，在15,10和5℃時菌體生長明顯受阻，與25℃相比差異顯著(P<0.05)； X1-2最適生長溫度為25℃， 低于20℃或高于30℃對菌體生長均產生明顯的差異(P<0.05)；X2在15～45℃之間生長差異不顯著(P>0.05)，且隨著溫度的上升，生長有增強趨勢，屬高溫菌(表4)。

2.3.2pH對菌體生長的影響試驗結果表明，3株細菌在pH為4.5～8.5之間均能生長，但最適生長的pH值存在較大差異。X1-1偏酸性，最適pH值為5.5，與pH為5.0差異不顯著(P>0.05)，大于5.5或小于5.0均存在顯著性差異(P<0.05)；X1-2生長的酸度范圍較廣；X2的最適pH均為8.5，大于或小于8.5存在顯著差異(P<0.05)。總體可見偏酸環境(pH<4.5)對3種菌均有不同程度的抑制作用，與對照無明顯差異(P>0.05)(表5)。

2.3.3鹽濃度對菌體生長的影響試驗表明，每種菌體的最適鹽濃度不同，X1-1最適鹽濃度為6.0%，與5.0%差異不顯著(P>0.05)，大于6.0%或小于5.0%均存在顯著差異(P<0.05)； X1-2最適鹽濃度為3.0%，與1.0%，1.5%，2.0%和2.5%差異不顯著(P>0.05)，說明X1-2耐鹽性較差；X2在0.5%～8.0%的鹽度范圍內生長差異不顯著(P>0.05)，即X2對鹽度具有廣泛的適應性，有一定的耐鹽能力；總體上3個菌株的鹽濃度承受值X2>X1-1>X1-2(表6)。

表4　溫度對菌株生長的影響

OD:平均OD值Mean of OD.同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Different letters in the same column indicate the significant differences (P<0.05). The same below.

表5　pH對菌株生長的影響

表6　鹽度對菌株生長的影響

2.4菌株形態特征和16S rRNA系統發育分析

綜合評價幾株細菌的CMC-Na水解圈試驗、濾紙崩解試驗以及中華羊茅分解試驗，菌株X1-2對纖維的分解能力最強，生長速度快，易培養，具有進一步研究開發的潛力，因此，本試驗通過形態學和分子生物學技術，對該細菌進行了分析鑒定(圖3和圖4)。

菌株X1-2為好氧、桿狀，周生鞭毛，能運動，菌落乳白色，表面無光澤且較粗糙，邊緣不整(圖3A)。在NA培養基上，易培養，生長較快，革蘭氏陽性菌(圖3B)。

圖3　菌株X1-2菌落和菌體形態Fig.3　Micrograph of strain X1-2 with colonies on a NA plate and its morphology 　A：NA培養基中菌落照片NA medium colony photos；B：革蘭氏染色顯微照片Gram staining micrograph.

圖4　菌株X1-2的16S rRNA序列系統發育分析Fig.4　Phylogenetic tree derived from 16S rRNA sequences of strain X1-2

由測序結果可知，菌株X1-2的16S rRNA 序列全長為1443 bp。通過與GenBank中序列比對，調取與之基因序列最為相近的菌種使用MEGA 5.0進行Clustal X多序列匹配比對，構建系統進化樹(圖4)。結果表明，菌株X1-2與芽孢桿菌系統發育關系密切。結合形態特征，初步確定菌株X1-2屬于芽孢桿菌屬中的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

3結論與討論

3.1多指標篩選體系的建立

濾紙屬纖維素類物質，能夠在濾紙上生長的菌種，說明可以利用濾紙作為碳源，濾紙片液體培養基中濾紙片的潰爛程度可以證明供試菌種具有纖維素分解能力。在本研究中首先以供試菌種在CMC-Na培養基的生長情況和透明圈大小作為指標，篩選出具有纖維素分解能力的細菌，然后結合濾紙平板上的生長情況、濾紙片液體培養基中的生長情況，選用多個指標進行初步篩選，避免了單一篩選方法的不足，多指標篩選體系的建立可防止試驗誤差可能出現的漏選菌種。

3.2纖維素分解細菌的特性

細菌分解纖維素時，首先是細菌黏附在纖維素上，在多種酶的協同作用或多纖維素酶的作用下，在接觸點纖維素被溶解，細菌從纖維素的表面向內增生，逐漸分解纖維素。由于天然分解菌活性低、降解速度慢，而纖維素的降解需要多種酶協同作用，所以充分利用自然界多種微生物的協同關系，人工篩選構建能夠產生多種纖維素酶的高效穩定菌系，引起了人們的高度重視。

3.3纖維素分解細菌穩定性的研究

穩定性試驗過程中發現，當外界條件(如溫度、pH值、鹽濃度)幾乎相同時，3個菌種一直很穩定。采用CMC-Na培養基和剛果紅染色相結合的方法進行篩選，淘汰了纖維素分解能力不穩定的菌株，保證了具有穩定遺傳特性的菌株基因資源，將菌株的穩定性作為一個指標進行篩選，目標性更強，并且具有實際的意義。

3.4培養條件對菌種的影響

研究供試菌種的培養條件對菌體生長的影響，對了解菌體的生物學以及生理學特性具有重要的意義，尤其是對一些新的微生物資源的認識和開發利用更具有不可估測的作用。本研究通過溫度、pH值、鹽濃度3個培養條件對菌體生長進行了初步研究。

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Isolation of cellulose-degrading bacteria and determination of their degradation activity

JIA Hui1, CHEN Xiu-Rong1*, LU Guang-Xin2*, KONG Ya-Li1, YANG Cheng-De1

1.KeyLabofGrasslandEcosystemofMOE,CollegeofPrataculture,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China; 2.DepartmentofGrasslandScience，AgricultureandAnimalHusbandryCollegeofQinghaiUniversity,Xining810016,China

Abstract:Eight bacterial strains were isolated from soil in the east Qilian Mountains. Of these, four strains had a higher capacity for degradation of plant cellulose when cultured on a CMC-Na plate medium. The growth characteristics of the four strains were studied, and the optimum temperature range of the 4 active strains was 25-30℃, the optimum pH for growth was 5-8, and the optimum sodium concentration was 4% to 5%. A strain designated X1-2 possessed the highest cellulose degradation ability. Based on morphology, gram stain reaction, and 16S rRNA phylogenetic comparison, this strain was identified as a member of the genus Bacillus (Bacillus sp.). It is a bacterium with strong plant cellulose degradation ability.

Key words:cellulose-decomposing bacteria; screening; biological characteristics; degradation

*通信作者

Corresponding author. E-mail:chenxiurong@gsau.edu.cn，lugx74@qq.com

作者簡介：賈輝(1981-),男,甘肅古浪人,在讀博士。E-mail:jiah66@163.com

基金項目：國家自然科學基金項目(31460152，41261064)和青海省科技廳項目(2014-ZJ-924Q)資助。

收稿日期：2014-04-08；改回日期：2015-09-07

DOI：10.11686/cyxb2014172

http://cyxb.lzu.edu.cn

賈輝，陳秀蓉，蘆光新，孔雅麗，楊成德. 纖維素降解細菌的篩選、生物學特性及降解效果. 草業學報, 2016, 25(3): 60-66.

JIA Hui, CHEN Xiu-Rong, LU Guang-Xin, KONG Ya-Li, YANG Cheng-De. Isolation of cellulose-degrading bacteria and determination of their degradation activity. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(3): 60-66.