我國北方9份旱生-沙生植物蒙古冰草遺傳多樣性研究

李曉全,高有漢,劉揚,索培芬,韓冰*

(1.內蒙古農業大學生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010010； 2.中國農業科學院草原研究所，內蒙古 呼和浩特 010010 )

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我國北方9份旱生-沙生植物蒙古冰草遺傳多樣性研究

李曉全1,2,高有漢1,劉揚1,索培芬1,韓冰1,2*

(1.內蒙古農業大學生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010010； 2.中國農業科學院草原研究所，內蒙古 呼和浩特 010010 )

摘要：蒙古冰草因其抗寒、抗旱特性，是歐亞大陸荒漠草原優勢植物之一。本文從染色體倍性及SSR序列長度多態性兩個方面對采自中國北方境內的9個蒙古冰草居群進行遺傳多樣性分析，發現9個蒙古冰草居群染色體基數為7，均為二倍體，在染色體倍性方面不具有多態性；共采用138對小麥SSR引物進行擴增分析，共有21對引物擴增出特異性條帶，SSR引物篩選率15.2%。共擴增出特異性條帶119條，平均每對引物擴增出特異性條帶5.6條，SSR序列長度多態性豐富。利用POPGEN 32軟件計算9個蒙古冰草居群遺傳多樣性指標，居群P8遺傳多樣性程度最低，居群P3最高。AMOVA分析顯示，蒙古冰草的遺傳差異主要是來自居群內個體之間。UPGMA方法聚類分析，在遺傳相似系數為0.80時，9個居群被分為三大類，居群P1～P6一類，居群P7、P8為第二類，P9被單獨分為一類。本研究為了解蒙古冰草遺傳背景及加速其資源的合理開發利用奠定了理論基礎。

關鍵詞：蒙古冰草；染色體倍性；SSR；遺傳多樣性

蒙古冰草(Agropyronmongolicum)又稱沙蘆草，多年生疏叢禾草，是旱生-沙生荒漠草原種。生長于干旱草原的典型砂質環境，在草原化荒漠中多以伴生成分出現。主要分布于中國內蒙古、河北、山西、寧夏、陜西、甘肅等省份[1]。蒙古冰草具有較高的營養價值，其粗蛋白質含量要高于其他一些禾本科牧草，如抽穗期羊草(Leymuschinensis)的粗蛋白質含量為13.52%，老芒麥(Elymussibiricus)為13.9%，而蒙古冰草則可高達18.64%，且整個生長期內，莖葉柔軟，適口性好，各類家畜均喜食[2]。而且蒙古冰草具有極高的生態價值，因其抗旱、耐寒等特性，適宜于干旱砂質地區生態型人工草地的建植。在鄂爾多斯高原沙地草場補播研究中，蒙古冰草是非常優良的牧草草種，明顯改善沙地草場生態環境[3]。

冰草屬是小麥屬的野生近緣種屬，其抗寒、抗旱、耐鹽、抗病蟲等優良抗性基因為小麥(Triticumaestivum)、大麥(Hordeumvulgare)等糧食作物的基因改良提供了良好的遺傳基礎。李立會等[4]將普通小麥與冰草(Agropyroncristatum)進行雜交，發現雜交后代表現出良好的株型結構，大穗多粒，兼抗白粉病和黃矮病，抗旱和抗寒等特點。蒙古冰草作為冰草屬中典型代表植物，也可與其他牧草進行遠緣雜交，從而改良原有牧草品質，培育新品種。

蒙古冰草是一種重要的資源植物，不僅具有極高的飼用價值，還具有極高的遺傳價值和生態價值。國外有關冰草的研究一直以生態建設、耐牧性和營養物質的運輸及儲存等為主[5-6]。而對冰草遺傳多樣性方面的報道很少[7]。我國對蒙古冰草遺傳多樣性的研究較多，并取得了很大進展。解新明等[8]利用等位酶法分析了蒙古冰草6個天然居群和2個栽培品種的遺傳多樣性和居群結構，得出居群內的遺傳多樣性高于居群間的結論。蘭保祥等[9]利用居群生物學方法，對35個蒙古冰草居群進行形態學性狀研究，發現蒙古冰草在形態學性狀上具有較豐富的遺傳多樣性，而且居群內遺傳多樣性大于居群間遺傳多樣性。包美蓮等[10]對蒙古冰草與航道冰草正反交雜種染色體加倍植株F2代及其與親本和雜種F1代進行ISSR分析得出親本蒙古冰草與航道冰草間、航道冰草與正反交雜種染色體加倍植株F2間存在較大遺傳距離。

蒙古冰草具有重要的生態價值、遺傳價值、飼用價值，為了更深入了解它的遺傳背景，加快蒙古冰草資源的合理開發利用以及為新品種的選育提供理論基礎，本研究從染色體倍性及DNA序列多態性兩個方面對采自中國北方的9個蒙古冰草居群進行遺傳多樣性分析。

1材料與方法

1.1材料

供試材料是9個蒙古冰草居群，其中P1、P2材料為本實驗室野外采集，其余材料為國家牧草種質中期庫提供(表1)。實驗于2013年2月到2013年12月室內進行。

種子于室溫暗處發芽之后移植于花盆，待幼苗長至5～8 cm時，每個居群隨機選10個單株用剪刀剪下葉片，蒸餾水沖洗兩遍，用濾紙吸干水后，置于-20℃保存。采用CTAB方法對葉片提取基因組DNA[11]，然后用瓊脂糖凝膠電泳檢測其含量和質量，-20℃保存備用。

1.2流式細胞術檢測染色體倍性

利用流式細胞術對供試蒙古冰草材料進行染色體倍性分析。待測細胞必須處于單細胞懸浮液狀態才可以直接進行測定，因此選用合適的分離液制備出高質量的單細胞懸液就成為流式分析的關鍵。配制不同的3種分離液，配方如下。

分離液①：0.2% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)[12]。

分離液②：檸檬酸 0.1 mol/L，0.2% Triton X-100[12]。

分離液③：OttoⅠ分離液：100 mmol/L 檸檬酸，0.5%(V/V)吐溫-20 (pH=2～3)；OttoⅡ分離液：400 mmol/L Na2HPO4·12H2O (pH=8～9)[13]。

表1　9個居群特征詳細介紹

以二倍體小麥進行分離液的篩選。室溫下，取植物新鮮葉片100 mg，加入1 mL細胞核分離液，用剪刀將葉片剪碎，50 μm孔徑過濾膜過濾，濾渣再加入1 mL分離液，過濾，合并濾液。2000 r/min離心3 min，棄上清，沉淀加分離液沖洗一次，離心，沉淀精確加入改良石碳酸品紅染色液0.5 mL，混勻染色2 min后用紅細胞計數板計數[12]。制備好的單細胞核懸液中加入200 μL 50 μg/mL碘化丙啶(PI)溶液，4℃暗處染色15 min后利用FACSCalibur流式細胞儀進行樣品檢測，單個樣本重復3次。

DNA 含量分布圖由流式細胞儀自動生成，數據用 Modfit 軟件進行分析。檢測中，用已確定染色體數目的二倍體小麥作對照材料調整流式細胞儀，使對照材料的主峰位于 50 道附近，由此儀器檢測圖示當中，50,100和 150道附近的峰顯示的細胞核相對DNA含量分別為50道的1,2和3倍。染色體倍性則為二倍體，四倍體，六倍體，其余為非整倍體。以下公式來計算核DNA含量或染色體倍性水平,待測樣DNA含量或倍性水平=對照樣核DNA含量或倍性水平×(待測樣本G0或G1熒光均值/參照樣本G0或G1峰熒光均值)。

1.3SSR分析

SSR引物參考Roder等[14]構建的小麥SSR分子標記連鎖圖，引物選取遵循均勻分布在每條染色體長臂、著絲粒附近、短臂的原則，使被選中的引物可以為蒙古冰草構建簡易標記連鎖圖。在http：//wheat.pv.usda.gov上找到相應的引物序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成共138對引物。PCR擴增體系為dNTP 1.4 μL、MgCl22.0 μL、rTaq酶 0.3 μL、正反向引物各0.5 μL和模板DNA 1.5 μL，總體系25 μL。PCR擴增反應程序為：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，50～60℃(根據引物的退火溫度設定)復性50 s，72℃延伸90 s，共35個循環，72℃延伸10 min，4℃保存。將PCR產物進行8%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,最后進行銀染觀察其條帶情況[15]。

在聚丙烯酰胺凝膠上以“0”和“1”統計SSR擴增條帶，在相同的遷移率位置上，有擴增條帶記為“1”，無擴增條帶記為“0”，構建原始“0，1”二元數列矩陣。用POPGEN 32軟件計算觀測等位基因變異數(observed number of alleles，NA)、有效等位變異數(effective number of alleles，NE)、多態位點百分比(percentage of polymorphic locus，PPL)、遺傳距離和遺傳一致性(Nei’s unbiased genetic distance and genetic identity)、香農指數(Shannon’s information index, SI)。用AMOVA軟件分析居群間、居群內遺傳變異。根據遺傳一致性，采用UPGMA法，利用NTSYS-pc v.2.02軟件作出聚類分析。并將聚類分析與地理距離用SPSS軟件進行相關性分析。

2結果與分析

2.1流式細胞術檢測染色體倍性

以小麥為參照物對3種分離液進行篩選，發現分離液③中單細胞核數明顯多于其他分離液，所以選取分離液③用于后續實驗(表2)。

從圖1的CK中看到，對照二倍體小麥的峰值在50道附近，即50道的G1期峰值為二倍體。調整閥值，使其G1期位于50道附近，以此檢測9個居群蒙古冰草的細胞核懸液。流式細胞儀測定結果顯示，所有居群的蒙古冰草G1期峰值處于50道附近，與對照小麥的倍性相同，均為二倍體，染色體基數為7(圖1,表3)。

表2　不同分離液從小麥中分離的細胞核數

2.2DNA提取結果

利用CTAB法提取了9個蒙古冰草居群的90個單株的基因組DNA，稀釋10倍之后各取1 μL基因組DNA和1 μL 6×Loading buffer混好后，用0.7%瓊脂糖凝膠檢測。從圖2中可以看出，基因組DNA條帶清晰、整齊、亮度也好，說明DNA 含量高，DNA較完整，沒有蛋白質污染，符合后續實驗要求。

圖1　蒙古冰草染色體倍性熒光分析圖Fig.1　Fluorescence analysis of A. mongolicum ploidy

居群Populations染色體倍性ChromosomeploidyS期細胞百分率ThepercentageofSperiodcells(%)G1期細胞百分率ThepercentageofG1periodcells(%)變異系數Coefficientofvariation(CV,%)居群Populations染色體倍性ChromosomeploidyS期細胞百分率ThepercentageofSperiodcells(%)G1期細胞百分率ThepercentageofG1periodcells(%)變異系數Coefficientofvariation(CV,%)CK257.3042.7010.84P5266.0633.6312.24P1258.6941.3110.99P6245.6854.3215.20P2256.4943.5111.91P7250.1549.8513.25P3257.7942.2113.39P8245.4954.5112.47P4258.0341.9712.56P9260.5839.4211.40

2.3多態性引物的篩選

圖2　蒙古冰草居群P1的10個單株基因組DNA電泳檢測圖Fig.2　The electrophoresis pattern of genome DNA of A. mongolicum from population P1

多態性擴增條帶數和其百分率是反映實驗材料多樣性程度的重要指標，同時也間接反映了引物的多態信息量。本研究采用的138對小麥SSR引物中有21對引物擴增到明顯差異性條帶，共119條，引物篩選率15.2%。所有引物中，引物wmc744擴增條帶數最多，為9條帶；引物wmc310、wmc491、wmc640(圖3)擴增條帶數最少，為3條。有效等位基因數(NE)和多態性信息指數(polymorphism information coefficient，PIC)等參數是體現群體變異的重要指標。PIC同時也反映了引物的多態性和區分居群的能力，其值依公式計算PIC=1-∑Pi2，其中Pi為第i個基因的基因頻率。SSR引物多態性信息指數(PIC)在0.321 (wmc640)～0.920 (cfd15) 之間，平均PIC為0.694(表5)。當PIC大于0.5時多態性高，在本研究中，PIC大于0.5的引物共17對，占81%；當PIC在0.25與0.5之間則多態性為中度，共有4對，分別為wmc109、wmc310、wmc468和wmc640，占19%；沒有引物的PIC低于0.25(低多態性)。說明這21對小麥SSR引物在蒙古冰草上具有較高的多態性，這21對引物可有效對9個居群進行區分。

圖3　引物wmc640對9個蒙古冰草居群單株基因組DNA的SSR擴增圖譜Fig.3　SSR amplification pattern of A. mongolicum genomic DNA from 9 populations by primer wmc640

2.4蒙古冰草居群遺傳多樣性

在9個居群中，多態基因位點數最多的是居群P3，為52個；多態基因位點數最少的是居群P8，為33個(表4)。這表明居群P8是9個居群中多樣性程度最低的一個居群，而居群P3則是多樣性程度最高的居群。等位基因數、有效等位基因數是描述遺傳多樣性的重要指標。等位基因數、有效等位基因數分別是居群P3、P4最高，表明這兩個居群內多樣性程度較高；居群P5、P7最低，則代表了這兩個居群內遺傳多樣性較低。

2.5蒙古冰草居群遺傳分化

居群的遺傳分化用Wright(1978)的F統計量來度量，其中Fis(the group of inbreeding coefficient，居群內近交系數)和Fit(the total number of inbred line， 總近交系數)分別表示整個物種的基因頻率和居群的平均基因頻率偏離Hardy-weinberg遺傳平衡的程度，Fst(the genetic differentiation，遺傳分化)表示居群間的遺傳變異占總遺傳變異的比率，用來衡量群體分化的程度。9個居群的居群內近交系數Fis和總近交系數Fit變化范圍分別是：-1.000(引物wmc167)到0.421(引物wmc491)之間、-0.249(引物wmc109)到0.690(引物barc158)之間，平均值分別是-0.164和0.242。遺傳分化系數Fst的變化范圍0.095(引物wmc109)到0.832(引物wmc167)之間，平均0.333。居群內近交系數Fis值為-0.164<0，表明供試材料居群內的隨機交配雜合度過量；總近交系數Fit值為0.242≠0，表明蒙古冰草總體存在一定的近親交配。基因流Nm(gene flow，基因流)與居群間的基因分化有關，即物種基因流越大，居群間遺傳分化越小，基因流Nm大,阻止居群間的遺傳分化。當Nm<1時，居群間大部分遺傳分化由遺傳漂變引起；當Nm>1時，則防止了因遺傳漂變而引起的居群間遺傳分化。本研究Nm在0.051(引物wmc167)到3.878(引物gwm664)之間，平均1.270(表5)，表明供試材料居群間存在較大基因流，說明基因的遺傳漂變將不會導致種群遺傳分化。

表4　9個蒙古冰草居群擴增情況

表5　引物擴增情況

Nm=1/4(1/Fst-1).

AMOVA分析結果表明，居群間變異為16.36%，居群內個體的變異百分比為83.64%(表6)。說明了蒙古冰草的差異主要是來自居群內個體之間。

表6　9個蒙古冰草居群遺傳結構的分子方差分析

圖4　9個蒙古冰草居群的UPGMA聚類圖 Fig.4　The UPGMA dendrogram for 9 A. mongolicum populations

2.6蒙古冰草居群聚類分析

利用POPGEN 32軟件計算各居群間遺傳距離和遺傳一致度，如表7。在居群間的遺傳一致度系數中，居群P2和居群P8之間遺傳一致度系數最小，為0.735，表明這兩個居群間遺傳距離最遠；居群P5和居群P6之間遺傳一致度系數最大，為0.959，表明這兩個居群間遺傳距離最近。依據Nei’s(1978)遺傳一致度數據，利用NTSYS軟件對9個蒙古冰草居群，采用UPGMA的方法進行聚類分析(圖4)，在遺傳相似系數為0.80時，9個居群被分為三大類，前6個居群被集中于第一類，居群P7、P8被分為第二類，居群P9被單獨分為一類。將聚類結果與地理距離利用SPSS軟件進行相關性分析，Pearson 相關性指數0.138<0.2，為無相關性。

3討論

蒙古冰草以其青綠期長，適口性好，被很多牲畜所喜食等諸多優點成為中國北方草原的優良草種，研究它的遺傳差異性為培育新品種提供理論基礎；并且其作為小麥等糧食作物的野生近緣種，又含有與抗旱、抗寒、耐貧瘠等相關的優良抗性基因，研究它的遺傳多樣性可為小麥等糧食作物的改良提供遺傳基礎。

細胞在分裂過程中因發生染色體異常性分離而導致的后代細胞中核內染色體數目不是染色體基數的整倍數的現象稱非整倍體發生。非整倍體是染色體變異材料，它的發現與應用是遺傳研究和染色體工程育種的一項重要內容。在植物及低等動物中，非整倍體對發育影響較小，很多非整倍體是可以存活的[16]，它的出現為遺傳多樣性研究提供了寶貴材料。

本研究從染色體倍性與DNA序列多態性兩個方面檢測蒙古冰草遺傳多樣性。利用流式細胞儀技術檢測發現所選蒙古冰草材料均屬二倍體植株，染色體基數為7，并不存在染色體非整倍性問題，供試材料在染色體倍性方面亦無遺傳多樣性，驗證了二倍體植物非整倍體的自然發生率較低的結論[17]。蒙古冰草與小麥染色體基數相同，因此試圖利用小麥SSR引物對蒙古冰草構建簡易染色體標記連鎖圖。用138對小麥SSR引物對采自不同地區的9個居群進行分析，共篩選出有明顯特異性擴增條帶的引物21對，篩選率15.22%。SSR引物具有通用性，通過梯度PCR技術利用小麥的SSR引物Xgwm32-3A對冰草進行了成功擴增[18]。于卓等[19]利用200對高粱(Sorghumbicolor)SSR引物對高丹草(sorghum hybrid sudangrass)新品系進行研究，發現有12對(6%)可擴增出有多態性、清晰的條帶。因蒙古冰草與小麥的近緣關系，因此測得的引物篩選率還是較高的。

遺傳分化是反映遺傳結構的重要指標。蒙古冰草居群間變異百分比為16.36%，居群內個體的變異百分比為83.64%，且差異均達顯著水平。表明蒙古冰草的遺傳多樣性主要來自居群內。這與蒙古冰草的異花授粉和風媒傳粉密切相關。這種結果與解新明等[8]研究結果相一致。這說明在蒙古冰草種質資源保護中，不僅要保護每個居群，同時更應該注重居群內個體間異質性的保護。基因流一定程度上能反映居群間遺傳物質的交流。大于1的基因流會抵制遺傳漂變的作用，防止由此導致的居群遺傳分化的發生。本研究中測得的居群間基因流Nm值為1.27，表明影響蒙古冰草遺傳結構的主導因素是由于居群內各個體間的差異。

對9個居群進行聚類分析發現，遺傳距離與地理距離并無相關性。居群P3與P8采自中國內蒙古巴彥淖爾市不同的旗縣，其遺傳相似系數為0.759，和居群P5與P6間遺傳相似系數0.959相比較小。表明供試9個蒙古冰草居群各自的地理分布并不是影響其群體遺傳結果的決定性因素。

4結論

采自中國北方境內的9個居群的蒙古冰草染色體基數為7，均為二倍體，9個蒙古冰草居群在染色體倍性方面不存在多態性，不存在非整倍體現象；21對SSR引物共擴增出特異性條帶119條，平均每對引物擴增出特異性條帶5.6條。在遺傳相似系數為0.80時，9個居群被分為三大類。本研究揭示了蒙古冰草的遺傳多樣性及遺傳結構影響因素，為物種種質資源保護和利用提供了重要依據。

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The genetic diversity of 9 populations of dry-desertAgropyronmongolicumcollected in northern China

LI Xiao-Quan1,2, GAO You-Han1, LIU Yang1, SUO Pei-Fen1, Han Bing1,2*

1.CollegeofLifeSciencesInnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010010,China; 2.GrasslandResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalSciences,Hohhot010010,China

Abstract:Agropyron mongolicum is one of the dominant species in desert steppe across Eurasia, due primarily to its cold and drought resistance. In this study, we analyzed chromosome polymorphism and DNA polymorphism in 9 populations of A. mongolicum in northern China. The chromosome number of the 9 populations was 7. Cells were diploid and showed no polymorphism in chromosome ploidy. A total of 138 pairs of wheat SSR primers were amplified and analyzed. A total of 21 primer pairs were amplified with specific fragments. The screening rate of SSR primers was 15.2%. A total of 119 specific bands were amplified: specificity was 5.6 and the polymorphism of DNA was rich. POPGEN 32 software was used to calculate the genetic diversity of the 9 populations of A. mongolicum. Population P8 was found to have the least level of diversity, while P3 had the highest. AMOVA software was used to analyze genetic differentiation, indicating that genetic differences come mainly from individuals in the populations. The UPGMA method was used for a cluster analysis of the 9 populations. When the genetic similarity coefficient is 0.80, the materials tested divided into three groups: P1-P6, P7-P8 and P9. This paper lays the foundation for the development and utilization of new varieties of A. mongolicum.

Key words:Agropyron mongolicum; chromosome ploidy; SSR; genetic diversity

*通信作者

Corresponding author. E-mail：hb_nmg@163.com

作者簡介：李曉全(1991-)，男，河北衡水人，在讀碩士。E-mail：1206966950@qq.com

基金項目：國家自然科學基金(31060057)，中國科學院西部之光“人才培養”項目匹配經費和中國農業科學院草原研究所農業科技創新工程資助。

收稿日期：2015-04-24；改回日期：2015-07-17

DOI：10.11686/cyxb2015219

http://cyxb.lzu.edu.cn

李曉全，高有漢，劉揚，索培芬，韓冰. 我國北方9份旱生-沙生植物蒙古冰草遺傳多樣性研究. 草業學報, 2016, 25(3): 77-85.

LI Xiao-Quan, GAO You-Han, LIU Yang, SUO Pei-Fen, Han Bing. The genetic diversity of 9 populations of dry-desertAgropyronmongolicumcollected in northern China. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(3): 77-85.