紫花苜蓿根頸芽越冬期間幼葉細胞超微結構的適應性變化

方強恩，張勃，李宇泊，師尚禮*

(1.草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅農業大學草業學院，甘肅省草業工程實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，

甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅農業大學信息科學技術學院, 甘肅 蘭州730070)

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紫花苜蓿根頸芽越冬期間幼葉細胞超微結構的適應性變化

方強恩1，張勃1，李宇泊2，師尚禮1*

(1.草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅農業大學草業學院，甘肅省草業工程實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，

甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅農業大學信息科學技術學院, 甘肅 蘭州730070)

摘要：為了探討紫花苜蓿根頸芽越冬抗寒的細胞學機理，本研究以WL168為材料，應用透射電鏡技術跟蹤觀察了根頸芽在自然越冬過程中幼葉細胞的超微結構變化。結果顯示，1)在越冬期間，苜蓿根頸芽幼葉細胞超微結構發生了一系列積極適應低溫的變化，主要表現為：質膜內陷，中央大液泡分割成多個小液泡，染色質凝集，質體變為月牙形或馬蹄狀，淀粉粒減少甚至消失，質壁分離等，細胞超微結構經過適應性調整，逐漸提高了根頸芽的抗寒能力。2)根頸芽在越冬期間同時存在白芽與褐芽兩種發育狀態，其中白芽幼葉細胞對越冬前的降溫反應遲緩，直到土壤封凍后才完全形成抗寒結構，但是到了翌年早春，細胞超微結構變化快速，很早便解除抗寒狀態，恢復生長。在整個越冬過程中白芽的抗寒性表現出4個不同的發育階段：抗寒性增強期(10月下旬至12月中旬)，抗寒性保持期(12月下旬至1月中旬)，抗寒性減退期(1月下旬至2月下旬)和抗寒性解除期(3月初至3月中旬)。相反，褐芽幼葉細胞在入冬前對氣溫下降提前作出了反應，但在翌年早春對氣溫的回升卻反應緩慢，到3月中旬，細胞結構依然保持抗寒特性。越冬期兩種根頸芽的存在以及細胞超微結構響應低溫的不同步性，是苜蓿越冬抗寒的一種適應策略。

關鍵詞：紫花苜蓿；根頸芽；超微結構；抗寒性

冬季低溫是影響紫花苜蓿(Medicagosativa，文中簡稱苜蓿)生長和地域分布的重要限制因子。近年來由于低溫引起的苜蓿凍害使我國苜蓿生產遭受了巨大損失[1]。隨著我國苜蓿種植面積不斷擴大，能否安全越冬已成為制約我國北方苜蓿草地成功建植和可持續利用的關鍵問題。目前，關于苜蓿的越冬抗寒機理尚未完全揭示，前人對于該問題的研究主要集中在根部形態及其生理生化特性等方面[2-8]。但是，Schwab和Barnes[9-10]在苜蓿凍害評級標準研究中指出，一旦根頸與根頸芽全部受凍變黑、腐爛，苜蓿便不會返青，即使此時主根可能還是鮮活的。孫啟忠等[11]的研究結果也支持這一觀點，認為根頸和根頸芽在判斷苜蓿越冬中起著決定性作用。可見，保證根頸與根頸芽的安全越冬才是苜蓿抗寒育種與栽培的核心。

一般認為，細胞器與膜結構的穩定性在抗寒鍛煉過程中的逐步提高是植物抵御冬季低溫脅迫的關鍵[12]。植物凍害的發生主要是由于低溫破壞了細胞的膜系統[13]，而葉器官則是植物最早、最直接感受外界環境變化的部位[14]。Niki[13]研究指出，在低溫處理中，葉片中前質體和葉綠體會首先表現出明顯的變化。簡令成等[15]研究發現，小麥(Triticumaestivum)的抗寒品種進入冬天寒冷季節時，其幼葉細胞中的前質體會發生相互嵌合的拉鏈現象，而在同樣條件下春小麥則不會產生此種現象。Lee等[16]、Ishikawa[17]、Murphy和Wilson[18]、李榮富和王麗雪[19]研究指出，低溫會使植物亞細胞結構發生一系列適應性變化，如：質體變為啞鈴形，細胞質基質致密度增加，質膜內陷，液泡吞噬作用增強，淀粉粒消失，線粒體內部結構出現空洞等。這些資料表明，迄今為止對于植物凍害發生與越冬抗寒的細胞學機理已經有了較深入的認識，這對植物凍害預防管理和抗寒力鑒定與評價等具有重要的參考意義。但是，目前有關苜蓿根頸芽越冬抗寒機理的研究尚未見報道。本試驗選取苜蓿抗寒品種WL168為材料，跟蹤觀察了根頸芽自然越冬過程中幼葉細胞超微結構的適應性變化，旨在從亞細胞水平闡明苜蓿根頸芽的越冬抗寒機制，以期為苜蓿抗寒育種與寒地栽培技術研究提供基礎資料。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料為WL168(M.sativa‘WL168’)，種子購自北京正道生態科技有限公司。WL168是近年來由美國牧草資源公司(Forage Genetics International，FGI)培育出的高產、優質、多抗紫花苜蓿品種，秋眠級為2，抗寒級為1。該品種適應性強，在我國東北、內蒙古、新疆、西藏、甘肅和青海等地均可種植，是干旱、寒冷地區的首選品種。

1.2試驗地概況及種植管理

試驗在甘肅農業大學蘭州牧草試驗站進行，該地區屬溫帶半干旱大陸性氣候，四季分明、光照充足。海拔1517.3 m。年平均降雨量320 mm，年日照時數2474.4 h。田間試驗小區面積3 m×3 m，4次重復。2014年4月10日播種。播前結合整地施磷肥750 kg/hm2、氮磷復合肥375 kg/hm2。條播，播種行距30 cm，播量為15 kg/hm2。播種深度1.5～2.0 cm。田間管理包括間苗、中耕除草、適時灌溉。播種當年分別于7月6日、8月25日兩次刈割，每次留茬高度均為5 cm。

1.3試驗方法

試驗在2014年10月至2015年3月間進行。圖1為試驗期內的日最高溫度與日最低溫度。取樣分4個時期，5次取樣：1)秋末低溫訓練期(10月25日)；2)初冬期(11月25日)；3)冬季嚴寒期(12月25日，1月25日)；4)早春返青期(3月15日)。采集時間均在上午9:30-12:00。每次采集不同類型芽各5～8個，迅速清洗干凈，以備切塊固定。

圖1　試驗期內(2014年10月20日至2015年4月1日)日最高溫度與日最低溫度Fig.1　The maximum and minimum temperatures in alfalfa growing period from October 20, 2014 to April 1, 2015　箭頭表示取樣時間。Arrows indicate the dates of collection.

在本試驗中，根據芽的發育狀態不同，將苜蓿根頸芽劃分為褐芽、白芽和綠芽3類。褐芽分布在地下根頸節區約1 cm范圍內，芽體很小，由數枚褐色的鱗片包裹；褐芽萌發后沖破鱗片發育為白芽，芽端白色或粉色，芽體大，主要分布在地面以下0～3 cm處；返青期白芽繼續發育，露出地面后轉變為綠芽，芽端綠色，有2～3枚即將展開的幼葉(圖2-11)。

透射電鏡樣品制備與觀察：將清洗干凈后的根頸芽立即放在預冷的載玻片上，滴上數滴冷的2.5%戊二醛固定液(固定液用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液配制，4℃下保存)，用鋒利刀片從芽端幼葉頂部切取0.1 cm×0.2 cm的小塊(褐芽需先剝去鱗葉)，迅速放進預冷的2.5%戊二醛固定液中，真空抽氣使樣品全部沉入底部，然后在4℃下預固定過夜。室溫下用磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)漂洗3次，每次15 min，再用1%四氧化鋨后固定2 h。吸出固定液，加入上述緩沖液漂洗1 h，中間換液4次，之后在50%，70%，80%，90%，95%，100%乙醇(2次)中逐級進行常溫脫水，每次20 min，EPON812環氧樹脂浸透、包埋、聚合，萊卡EMUC6超薄切片機切片，厚度為70 nm。然后將超薄切片撈于載物網上，經醋酸雙氧鈾(30 min)和檸檬酸鉛(10 min)進行雙重染色，在JEM-1230(日本)型透射電鏡下進行觀察拍照。

2結果與分析

2.1秋末低溫訓練期根頸芽幼葉細胞的超微結構

從10月25日取樣制片中可以看出，苜蓿在秋季低溫訓練期其白芽幼葉細胞超微結構完整，核位于細胞邊緣，核膜清晰，核質分布均勻，核仁大，清晰可見；在細胞周緣圍繞細胞核和液泡分布著豐富的質體和線粒體。質體被膜完整，圓形、卵圓形或橢圓形，其中能看到正在分裂增殖的質體(圖2-1，白色箭頭)，有些質體中晶格狀原片層正在發育形成類囊體(圖2-3)；胞間連絲為“直型通道”型，明顯可見(圖2-4)。質膜光滑，尚未發生質壁分離，質膜處有外吐(exocytosis)和內吞(endocytisis)現象發生(圖2-4，白色箭頭)，這表明白芽幼葉細胞還處在較活躍的生長發育期。但受秋季低溫的影響，中央液泡隨之發生了適應性變化，具體表現在：液泡表膜不光滑連續，甚至有些區域液泡膜將大量的細胞質小球卷入其內，增加了液泡內濃度(圖2-2，白色箭頭)；同時在質體中可以看到有淀粉積累(圖2-1,2,3,4)。

圖2　紫花苜蓿根頸芽秋末與初冬期幼葉細胞超微結構的變化Fig.2　Changes in young leaf cell ultrastructure of alfalfa crown buds in the late autumn and early winter　1～4：秋末(10月25日)白芽幼葉細胞的超微結構；1：質體豐富，有些質體正在分裂增殖(白色箭頭)，核膜清晰，核仁大；2：大液泡正在吞噬細胞質小球(白色箭頭)；3：質體中可見晶格狀原片層(白色箭頭)；4：質體中有淀粉積累，質膜出現小泡(白色箭頭)；5～6：秋末(10月25日)褐芽幼葉細胞的超微結構；5：大液泡分割出多個小液泡，核仁邊緣模糊；6：核仁消失；7～8：初冬期(11月25日)白芽幼葉細胞的超微結構；7：大液泡正在分割，核向中央靠近，核仁變小；8：質體月牙形，淀粉消失，周圍有線粒體聚集；9～10：初冬期(11月25日)褐芽幼葉細胞的超微結構；9：質體馬蹄狀，液泡稀少，核仁消失；10：質體中積累了大顆粒淀粉，細胞核中染色質發生凝聚；11：苜蓿根頸芽的3種不同類型：褐芽、白芽、綠芽。V：中央大液泡；sV：小液泡；P：質體；Sg：淀粉粒；Cw：細胞壁；M：線粒體；ER：內質網；N：細胞核。下同。1、2、4、9、10圖中，標尺=1 μm；7、8圖中，標尺=2 μm；3、5、6圖中，標尺=0.5 μm。1-4：Cell ultrastructure of white bud in late autumn (Oct. 25)；1：The cell with numerous plastids，nucleus membrane is clear and nucleolus is large，some plastids are dividing to proliferate (white arrow)；2：The large central vacuole is swallowing cytoplasm (white arrow)；3：Plastid with a crystal prolamellar body (white arrow)；4：Starch accumulates in plastid, some vesicles begin to form on plasmalemma (white arrow)；5-6：Cell ultrastructure of brown bud in late autumn (Oct. 25)；5：The large central vacuole is segmented into multiple small vacuoles，the edge of nucleolus becomes blur；6：Nucleolus is disappeared；7-8：Cell ultrastructure of white bud in early winter (Nov. 25)；7：The large central vacuole is segmented，nucleus closes to the central, nucleolus becomes smaller；8：Starch grain is disappeared，plastids become crescent-shaped which mitochondria is clustered around；9-10：Cell ultrastructure of brown bud in early winter (Nov. 25)；9：Plastids become horseshoe-shaped，vacuole is rare，nucleolus is disappeared；10：A great amount of starch accumulate in plastid，chromatin is agglutinated；11：Showing three types of crown bud：brown bud，white bud and green bud．V：Large central vacuole；sV：Small vacuole；P：Plastid；Sg：Starch grain；Cw：Cell wall；M：Mitochondrion；ER：Endoplasmic reticulum；N：Nucleus.The same below. Scale bars=1 μm in 1，2，4，9，10；2 μm in 7，8；0.5 μm in 3，5，6.

褐芽與白芽相比，質體小，片層結構較少，其中看不到淀粉粒(圖2-5,6)；大液泡已經開始分割出很多小液泡；核仁邊緣變得模糊，甚至有些細胞核仁消失(圖2-5,6)。在質膜處亦然有吞吐現象發生，仍未發生明顯的質壁分離(圖2-6)。

2.2初冬期根頸芽幼葉細胞的超微結構

在初冬期(11月25日)，最低氣溫已經降至零度以下(圖1)，地面即將封凍，此時通過透射電鏡看出，白芽幼葉細胞中細胞壁較前期增厚，大液泡已經分割出了許多小液泡，并向質膜靠近(圖2-7)。在細胞邊緣分布的液泡周圍整齊地環繞著數量豐富的內質網(圖2-8)。質體變為變形蟲狀或月牙形，周圍有線粒體分布(圖2-7,8)。核移到了細胞中央附近，核仁變小，并受低溫影響發生出芽現象(圖2-7)，甚至有些細胞已分裂出兩個核仁(圖2-8)。此期質膜依然光滑，未發生質壁分離。質體中淀粉消失(圖2-7,8)。

褐芽對初冬低溫的適應性變化較白芽更為強烈，細胞核中染色質發生不同程度的凝聚(圖2-10)。在核周圍聚集著多個體積較大的淀粉粒(圖2-10)，有些細胞核仁依然消失，質體變為馬蹄形，淀粉水解(圖2-9)。大液泡完全消失，小液泡數量減少，體積近等大，在細胞內無規律地分布(圖2-10)。

2.3冬季嚴寒期根頸芽幼葉細胞的超微結構

12月25日，地面已經封凍約20多天，天氣轉入冬季嚴寒期。從透射電鏡看出，白芽幼葉細胞中大液泡已經全部分割為體積近等大的小液泡，液泡總數量減少，細胞質變得濃密(圖3-1,2)；細胞核膜周緣分布有少量異染色體，有些細胞中核仁消失(圖3-2)；在細胞中靠近質膜的區域還能清晰地看到高爾基體及其產生的大量高爾基小泡(圖3-3)，質膜內陷呈波狀，質壁分離現象開始發生，由此隔斷了胞間連絲(圖3-4)。質體中片層結構清晰(圖3-3)。

此時，褐芽幼葉細胞中細胞質更加濃密，液泡很少(圖3-6,7,8)，質體中含有體積較大的淀粉粒，且電子致密度高(圖3-7)，線粒體數量增加，質壁分離現象明顯(圖3-7,8)。

到1月25日，白芽幼葉細胞中液泡開始大量吞噬細胞質小泡和細胞器，體積變大，小液泡正在減少或已消失(圖3-9,10,11,12)；質體中淀粉積累量增多，淀粉粒的電子致密度不一(圖3-9,10)，有些細胞中還產生了復合造粉體(圖3-10)；線粒體數量豐富(圖3-11)。此時褐芽中液泡的吞噬和融合現象更明顯，液泡通過吞噬作用融合吸收了細胞質小泡(圖3-13,14)，增加了膜面積，另外通過質膜的內吞作用從外界獲得水分和能量。質體中淀粉粒的電子致密度增加，復合造粉體圍繞細胞核分布，在造粉體周圍及其鄰近區域有內質網清晰可見(圖3-15,16)。

2.4早春返青期根頸芽幼葉細胞的超微結構

在早春返青期(3月15日)，天氣回暖，土壤解凍，大量白芽萌發出土發育為綠芽。此時綠芽幼葉細胞質膜已恢復至光滑狀態，質壁分離現象消失(圖4)。液泡通過自體吞噬和質膜內吞作用(圖4-4)，使之不斷擴大，形成中央大液泡。細胞核從中央移至質膜附近；質體發育為葉綠體，類囊體排列整齊，片層結構清晰，其內很少再有淀粉積累。有些葉綠體正通過橫縊分裂進行增殖，周圍分布有豐富的線粒體(圖4-1)；在原維管組織細胞中，裝載有細胞壁材料的高爾基小泡被輸送到質膜，通過外吐作用將其內部物質釋放到質膜外的細胞壁中(圖4-3)。由于質壁分離現象的消失，胞間連絲也恢復功能，為細胞間的物質交換提供通道(圖4-6，白色箭頭)。幼葉維管束中的伴胞被修飾成傳遞細胞(transfer cell)，通過增加質膜表面積增強細胞間物質的運輸功能(圖4-5)。

與綠芽相比，此期褐芽發育變化比較緩慢，液胞仍然進行著吞噬和水合(圖4-7,8,9)，部分細胞核仁尚未出現(圖4-9)，質體幼小，數量少，零星分布在細胞質中(圖4-7,8)；質膜光滑，質壁分離現象消失；細胞中淀粉粒完全水解，造粉體消失。在質膜周圍分布有數量豐富的內質網(圖4-9)。

圖3　紫花苜蓿根頸芽嚴冬期幼葉細胞超微結構的變化Fig.3　Changes in young leaf cell ultrastructure of alfalfa crown buds in the deep winter　1～4：嚴冬期(12月25日)白芽幼葉細胞的超微結構；1：大液泡消失，核膜周緣分布少量異染色體(白色箭頭)；2：核仁消失；3：質體中片層結構清晰，質體周圍有高爾基體分布；4：質膜內陷呈波狀；5～8：嚴冬期(12月25日)褐芽幼葉細胞的超微結構；5：淀粉粒電子致密度高；6：核仁消失，液泡稀少；7：線粒體數量增加；8：發生質壁分離；9～12：嚴冬期(1月25日)白芽幼葉細胞的超微結構；9：淀粉數量豐富；10：出現造粉體(白色箭頭)；11：線粒體數量增加；12：液泡吞噬了大量細胞質小泡和細胞器(白色箭頭)；13～16：嚴冬期(1月25日)褐芽幼葉細胞的超微結構；13～14：液泡開始吞噬、融合，體積增大(白色箭頭)；15：淀粉粒體積大，電子致密度高，周圍分布大量內質網；16：很多造粉體圍繞在細胞核周圍。Pm：質膜；Ga：高爾基體。1、2、6、9、11、14、15圖中標尺=1 μm；5、12、16圖中標尺=2 μm；4、7、8、10、13圖中標尺=0.5 μm；3圖中標尺=0.2 μm。1-4：Cell ultrastructure of white bud in the deep winter (Dec. 25);1：The large vacuole is disappeared，a small amount of heterochromosome is distributed at the edge of the nuclear membrane (white arrow)；2：Nucleolus is disappeared；3：Plastid lammelar is clear, Golgi apparatus occurs around plastid；4：Plasmalemma is invaginated, looked like a wavy；5-8：Cell ultrastructure of brown bud in the deep winter (Dec. 25)；5：The starch grains with great electronic density；6：Nucleolus is disappeared，vacuole is rare；7：The number of mitochondria is increased；8：Plasmolysis occurs in this period；9-12．Cell ultrastructure of white bud in the deep winter (Jan. 25 of next year)；9：Numerous starch grain accumulates in the plastid；10：Amyloplast emerges (white arrow)；11：The number of mitochondria is increased；12：Vacuoles have swallowed up a large number of vesicles and organelles (white arrow)；13-16：Cell ultrastructure of brown bud in the deep winter (Jan. 25 of next year)；13-14：Vacuoles begin to devour each other and amalgamate (white arrow)；15：Starch grains with larger volume and greater electronic density，numerous endoplasmic reticulum occurs around the starch grain；16：Many amyloplasts appear close to nucleus．Pm：Plasmalemma；Ga：Golgi apparatus．Scale bars=1 μm in 1，2，6，9，11，14，15；2 μm in 5，12，16；0.5 μm in 4，7，8，10，13；0.2 μm in 3．

圖4　紫花苜蓿根頸芽早春期幼葉細胞超微結構的變化Fig.4　Changes in young leaf cell ultrastructure of alfalfa crown buds in the early spring　1～6：早春期(3月15日)綠芽幼葉細胞的超微結構；1：中央大液泡形成，細胞核被擠到邊緣，葉綠體正在分裂增殖(白色箭頭)；2：由質體發育而來的葉綠體中類囊體排列整齊，周圍分布有豐富的線粒體；3：高爾基小泡(白色箭頭)被運輸到細胞壁中；4：液泡正在吞噬；5：幼葉維管束中伴胞被修飾成傳遞細胞；6：胞間連絲清晰可見(白色箭頭)；7～9：早春期(3月15日)褐芽幼葉細胞的超微結構；7：質體數量稀少，造粉體消失；8：大液泡尚未完全形成，液泡仍進行著吞噬與融合；9：質膜周圍有豐富的內質網。Ch：葉綠體。1、2、4、5、6、7、9圖中標尺為1 μm；3和8圖中標尺為0.5 μm。1-6：Cell ultrastructure of green bud in early spring (Mar.15 )；1：The large central vacuole has been formed，nucleus is pushed to the edge of cell，chloroplasts are proliferating (white arrow)；2：Thylakoids orderly arrange in chloroplast，numerous mitochondrions is distributed around the thylakoid；3：Golgi vesicles (white arrow) are transported to the cell wall；4：Vacuoles are swallowing up each other；5：Transfer cell occurs in the vascular bundles of young leaf；6：Plasmodesmata is clearly visible (white arrow)；7-9：Cell ultrastructure of brown bud in early spring (Mar.15 )；7：Plastid is disappeared，amyloplast becomes rare；8：The large central vacuole is not yet fully formed，vacuoles are still swallowing each other；9：Numerous endoplasmic reticulum is distributed close to the plasmalemma．Ch：Chloroplast．Scale bars=1 μm in 1，2，4，5，6，7，9；0.5 μm in 3 and 8．

3討論

3.1根頸芽幼葉細胞超微結構對秋冬低溫的適應

從上述研究結果可以看出，苜蓿根頸芽在越冬期間，幼葉細胞中質膜、質體、液泡、細胞核等超微結構發生了明顯的變化。一般認為，質膜是寒害或凍害損傷的最初部位，為了抵抗低溫凍害，質膜在抗寒鍛煉或低溫脅迫時會產生抗寒性的適應性變化[20]。在本文中，根頸芽幼葉細胞在秋末低溫訓練期，質膜通過內陷或外凸(圖2-4,6)形成小泡，這些小泡不但能將細胞內物質外排到質膜和細胞壁之間，防止質壁分離處產生冰凍[20]，還能克服質膜對大分子物質通透性的限制，增加細胞質的濃度，降低冰點，最終提高植物抗寒性[21]。可見，秋冬低溫條件下苜蓿根頸芽細胞中質膜內陷是一種積極的適應行為。

本研究發現，在初冬期(11月25日)苜蓿根頸芽細胞壁較前一時期顯著增厚(圖2-7,8,9,10)。簡令成和王紅[22]分析指出，低溫鍛煉下植物細胞壁之所以會發生次生加厚和木質化，是因為低溫鍛煉期質膜會頻頻出現外吐現象，細胞通過質膜的外吐作用將細胞質小泡(包括小液泡)中包含的大分子物質釋放到質膜外，參與細胞壁的構建，以增加細胞壁的堅固性。這一適應性變化可以防止植物細胞因冰凍失水而造成機械性損害。在初冬低溫鍛煉過程中，冬油菜(Brassicanapus)[23]、冬小麥[24]、桑樹(Morusbombciz)[25]、云杉(Piceaasperata)[26]等植物細胞壁都表現出了相同的適應性變化。Rajashekar和Lafta[27]研究指出，抗寒鍛煉加富了細胞壁結構成分胼胝質、纖維素、半纖維素和果膠質的積累，尤其是木質素和伸展蛋白(extensin)在細胞壁中的沉積，后二者能大大增強細胞壁的堅硬度，而且，細胞壁中伸展蛋白的沉積可以提高細胞的抗凍性[28]。

液泡是一種水相體系，因而也是發生冷害的最危險部位，對低溫冰凍敏感，極易受低溫脅迫。本研究結果顯示，苜蓿根頸芽幼葉細胞中液泡是所有膜系統中對秋季低溫最敏感的。從10月25日采樣中看出(圖2-2)，此時線粒體、質體、質膜等均結構完整清晰，唯有液泡表膜出現較大變化，形狀變得不規則，膜發生反卷和內陷，形成吞噬泡，把部分細胞質和細胞器吞噬到液泡中，在液泡中出現了多層膜結構或小泡(圖2-6)。液泡的內吞作用被認為與植物的抗寒性和抗凍鍛煉密切相關[29-30]。Sangwan等[31]認為，由液泡膜內吞而進入液泡的細胞質和膜狀結構，經有關酶降解后可變為蛋白質及RNA等大分子物質。韓善華等[32]通過組化分析發現，在冬季沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)葉肉細胞中，液泡內含物含有大量的脂類物質。由此分析，苜蓿根頸芽液泡膜大量內吞，有助于提高液泡中的液體濃度，這樣可以減慢水分向細胞質滲透的速度，降低冰點。此外，被內吞的膜狀物質降解后還可作為合成膜的原料貯存在液泡中，一旦液泡膜受到損傷和破壞，它就能使液泡膜迅速修復和很快合成[32]。因此，苜蓿根頸芽幼葉細胞中出現液泡膜的大量內吞，并非偶然現象，很可能與其抗寒性的形成有關。

細胞核是DNA復制和DNA轉錄的特區，是有機體生長和發育的控制中心，因而它必然也是植物對逆境反應和適應的控制中心。低溫下保證細胞核的存活對于維持植株的存亡至關重要。Ritali和Ashworth[33]認為，木本植物木射線薄壁細胞在冷脅迫中，染色質會發生凝聚。但Jian等[34]指出，冬小麥在越冬過程中染色質的分布沒有發生聚集現象。本研究中，在初冬期和冬季嚴寒期，褐芽和白芽細胞核中染色質分別發生了不同程度的凝聚(圖2-10，圖3-1)。一般認為，染色質在冬季發生暫時性凝集是遏制DNA轉錄和mRNA新合成、誘導生理休眠的一種內在機制[22]。

質體是和糖類合成與貯藏密切相關的細胞器。當受外界環境影響時，質體常發生變形，多變為啞鈴形、變形蟲狀、馬蹄形或環形等[35]。目前關于質體變形的原因，存在多種解釋。有研究認為，質體變形是質體發育過程中的正常現象[36]，它只是一種不同形態類型的造粉體[35]。楊濤等[37]認為，啞鈴形質體的出現表明質體正以分裂的方式來增加數目。還有報道指出，變形的質體可能承擔著分泌功能[38]。據本研究觀察，在秋末低溫訓練期(10月25日)，苜蓿根頸芽幼葉細胞中質體被膜完整，卵圓形或橢圓形，有淀粉粒積累其中(圖2-2,3,4)。但到初冬期(11月25日)，質體變為月牙狀或馬蹄形(圖2-7,8)，此時其中積累的淀粉粒明顯減少甚至消失，并且質體周圍有線粒體聚集，由此推測，質體變形可能是細胞分解淀粉粒的一種表現，聚集的線粒體可為其提供能量。低溫下質體通過分解淀粉粒來增加細胞質中的可溶性糖濃度[22]，從而提高植株的抗寒性。在許多試驗中均觀察到，逆境脅迫可導致線粒體數量增加[39-40]。低溫雖然一定程度上降低了線粒體和質體的活性，但它們通過增加數量來保證能量供給，因此，線粒體數量的增加可以認為是對低溫等逆境作出的一種積極的、補償性的反應。

3.2苜蓿根頸芽自然越冬過程中抗寒性的變化

上述分析表明，根頸芽在秋冬低溫鍛煉中(10月至11月)，細胞內質膜、液泡、細胞核與質體的結構與功能經過積極的適應性變化，逐步增強了苜蓿的越冬抗寒力。到12月25日，時值嚴冬，從該期取樣中可以看到(圖3-4)，此時苜蓿根頸芽幼葉細胞發生了質壁分離。大量研究結果表明，多年生植物在低溫脅迫下所發生的質壁分離，是保證自身安全越冬的一種適應機制[22]。質壁分離發生時，質膜通過內陷形成波浪狀結構，以此增加質膜量，這樣可以防治冰凍脫水后細胞收縮對質膜產生損傷，從而有效避免在嚴冬季節發生凍害。有報道指出[20]，細胞質壁分離還能使胞間連絲中斷，共質體連續性被破壞，植株停止生長或生長減弱，進入暫時休眠。

據此分析，通過前期的自然低溫鍛煉，到嚴冬時期苜蓿根頸芽細胞內生理活動已經減弱至極低點，以休眠狀態抵御凍害。但是，從試驗結果看，芽休眠維持時間并不長，到1月下旬，細胞又開始變得活躍起來，主要表現在：小液泡之間開始融合、變大；有些質體幾乎完全被淀粉粒所充滿，轉變為造粉體(圖3-10,15,16)，在造粉體周圍可看到環繞著較多的內質網(圖3-15)。簡令成和王紅[22]認為，發育中的造粉體會與內質網形成一種復合體(amyloplast-ER complex)，這是碳水化合物代謝和淀粉粒合成的聯合體系，內質網可能為造粉體起著物質運輸通道的作用。由此表明，在1月下旬苜蓿根頸芽細胞的抗寒結構特征已開始發生變化，造粉體開始形成，為返青期根頸芽出土生長作能量供給上的準備。

3月中旬，氣溫回升，此時大量白芽萌發出土發育為綠芽，綠芽幼葉細胞的質壁分離現象消失；液泡通過自體吞噬作用形成中央大液泡；質體發育為葉綠體；胞間連絲恢復功能；幼葉維管束中出現傳遞細胞(圖4)。以上特征均表明，在3月中旬，白芽已完全恢復生長，幼葉細胞結構已不再表現抗寒特征。但此期褐芽發育比較緩慢，細胞超微結構仍然保持抗寒性，如：液胞間仍進行著吞噬和水合，細胞內還未完全形成中央大液泡；核仁缺失，質體幼小等。

由以上分析可以看出，苜蓿自然越冬過程中白芽的抗寒性明顯表現出了4個不同的發育階段：抗寒性增強期(10月下旬至12月中旬)；抗寒性保持期(12月下旬至1月中旬)；抗寒性減退期(1月下旬至2月下旬)；抗寒性解除期(3月初至3月中旬)。但是，褐芽在本試驗開始時(10月25日)就已表現出了抗寒性，而且到試驗結束時(3月15日)抗寒性還未完全解除，因此關于褐芽抗寒性的完整發育過程還需進一步研究。

3.3褐芽和白芽對冬季低溫的適應性差異

在西北地區，霜降之后，即10月底至11月中旬，苜蓿地上部分因凍害而逐漸枯死，其越冬主要依靠地下根頸芽[41]。因此，根頸芽能否安全越冬，直接決定苜蓿的越冬率和翌年草產量。前人一直僅把苜蓿地下白色或粉紅色的芽視為根頸芽[42-43]。但根據本研究觀察，發現苜蓿越冬前根頸芽存在著兩種發育狀態：一類芽在土壤封凍前已經在地下萌發，鱗葉枯落，芽體較長，白色或粉紅色(文中記為白芽，圖2-11)；另一類芽則始終被褐色鱗葉包裹，處于潛伏狀態(文中記為褐芽，圖2-11)。褐芽雖然芽體小，萌發遲，但其數量龐大。進一步觀察發現，在正常情況下，褐芽不會出土生長，當地上莖葉和正在發育的白芽遭到損傷而失去發育能力時，褐芽會發育為白芽，萌發出土形成地上枝。本試驗通過觀察比較白芽和褐芽在越冬期間幼葉細胞超微結構的變化，發現兩種芽在越冬過程中具有不同的適應特點：在秋末低溫鍛煉期，白芽細胞超微結構完整，核仁大，核膜清晰，質體和線粒體豐富，質體正在分裂增殖，表明此時期細胞生長代謝仍較活躍，但褐芽此時已經對低溫變化作出了反應，表現在：核仁邊緣模糊或者核仁消失，大液泡分割出很多小液泡。在初冬期，白芽細胞中液泡開始分割，質體變形，核仁變小，淀粉消失，此時褐芽反應更為強烈，細胞核中染色質出現輕微凝聚，大液泡完全消失；到嚴冬期，白芽和褐芽均出現質壁分離。在早春返青期，天氣回暖，白芽萌發出土發育為綠芽，幼葉細胞內中央大液泡已形成，質體發育為葉綠體，質壁分離消失，出現傳遞細胞，細胞間物質的運輸功能增強。相比之下，此時褐芽細胞中，小液泡間仍進行著吞噬和水合，中央大液泡尚未形成，但淀粉粒已完全水解，核仁缺失，質體數量少，表明細胞生長緩慢，仍然保持抗寒特性。

綜上所述，苜蓿根頸芽是以白芽和褐芽兩種不同的發育狀態越冬的，而且，兩種芽在越冬期間表現出不同的適應特性：白芽對越冬前氣溫下降反應遲緩，直到土地封凍后芽生長才結束，但它對返青期的氣溫回升反應敏感，很早便開始萌發生長。相比之下，褐芽入冬前能夠對低溫提前做出反應，以適應隨后到來的冬季嚴寒；但在早春返青時，對氣溫的回暖變化反應緩慢。一般認為，北方地區早春氣溫先暖后冷的“倒春寒”是導致苜蓿凍害發生的主要原因[1]，褐芽對早春氣溫變化不敏感的這一特點，正好可以避免倒春寒的危害。可見，苜蓿越冬期兩類根頸芽的存在，既保證了返青期的高產，又可以預防冬季嚴寒和倒春寒的危害，保存生長點，這正是苜蓿越冬抗寒的一種適應策略。

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Adaptive changes in the young leaf cell ultrastructure of crown buds inMedicagosativa(Leguminosae) during overwintering

FANG Qiang-En1, ZHANG Bo1, LI Yu-Bo2, SHI Shang-Li1*

1.KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,SinoU.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China； 2.CollegeofInformationScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

Abstract:In order to explore the cytological mechanism of cold resistance in alfalfa crown buds during winter, a study of ultrastructural changes in young leaf cells of crown buds in the alfalfa variety ‘WL168’ was conducted by means of TEM. The results showed that: 1) a series of active changes in cell ultrastructure adapted to cold temperature take place during overwintering. The major changes included plasmalemma invaginations, the large central vacuole segmentation into multiple small vacuoles, chromatin condensation, plastid becoming crescent or horseshoe-shaped, starch grains depletion or even disappearance and plasmolysis. The capacity for cold resistance in buds was improved gradually by these adaptive adjustments of cell ultrastructure. 2) Two kinds of crown buds were found in winter: white bud and brown bud. These two kinds have different cellular growth states. The white bud cells had a slow response to cooling before winter and did not fully form specialized structures for winter hardiness until soil freezing, but they regrew quickly after cold resistance release in early spring. The cold resistance development of white buds during overwintering went through 4 phases: enhanced phase (late Oct-mid-Dec), maintenance phase (late Dec-mid-Jan), decline phase (late Jan-late Feb) and termination phase (early Mar-mid-Mar). In comparison, brown bud cells responded earlier to low temperatures before winter but more slowly to the warming of temperatures in spring. By mid-March, the cellular structure of brown buds still maintained their cold tolerance. The coexistence of brown and white buds during winter, whose cell ultrastructure changes asynchronously in response to low temperature, could be an adaptive strategy of alfalfa to cold stress.

Key words:alfalfa (Medicago sativa)； crown bud； ultrastructure； cold resistance

*通信作者

Corresponding author. E-mail: shishl@gsau.edu.cn

作者簡介：方強恩(1980-)，男，甘肅天水人，講師，博士。E-mail:fangqen@163.com

基金項目：國家現代牧草產業技術體系-栽培與草地管理(CARA-35)，農業部牧草種質資源保護與利用(NB2130135)和甘肅農業大學盛彤笙科技創新基金(GSAU-STS-1228)資助。

收稿日期：2015-09-22；改回日期：2015-11-16

DOI：10.11686/cyxb2015443

http://cyxb.lzu.edu.cn

方強恩，張勃，李宇泊，師尚禮. 紫花苜蓿根頸芽越冬期間幼葉細胞超微結構的適應性變化. 草業學報, 2016, 25(3): 96-107.

FANG Qiang-En, ZHANG Bo, LI Yu-Bo, SHI Shang-Li. Adaptive changes in the young leaf cell ultrastructure of crown buds inMedicagosativa(Leguminosae) during overwintering. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(3): 96-107.