賀蘭山野生酸棗黃酮含量及抗自由基活性的研究

楊安安，丁潤梅（.寧夏醫科大學臨床醫學院，寧夏銀川　750004；.寧夏醫科大學基礎醫學院，寧夏銀川　750004）

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賀蘭山野生酸棗黃酮含量及抗自由基活性的研究

楊安安1，丁潤梅2
（1.寧夏醫科大學臨床醫學院，寧夏銀川750004；2.寧夏醫科大學基礎醫學院，寧夏銀川750004）

摘要：以賀蘭山野生酸棗為研究對象，采用索氏提取法以不同濃度的乙醇為溶劑提取總黃酮，并利用單因素試驗優化提取賀蘭山野生酸棗的工藝參數；采用DPPH法研究提取物的抗自由基活性。研究表明：賀蘭山野生酸棗的最佳提取條件為乙醇濃度70 %，料液比1:30，提取時間6 h時，提取物中黃酮含量最高為0.490 %；提取物對DPPH自由基有較好的清除作用，清除率達81.66 %，證明賀蘭山野生酸棗有一定的抗自由基活性。

關鍵詞：賀蘭山野生酸棗；總黃酮；DPPH法；清除自由基活性

酸棗別名山棗、野棗、棘等，鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（Ziziphus）植物，酸棗是棗的原生種，在我國分布較廣[1，2]，是盛產于我國北方的野生果樹和野生藥用植物資源。酸棗是我國35種貴重中藥材之一，中醫典籍《神農本草經》記載，酸棗“味酸平，主治心腹寒，熱邪結氣，四肢酸疼，濕痹，久服安五臟輕身延年”。研究表明，酸棗仁性味甘平，具有安神鎮靜作用，酸棗葉中可以提取到酸葉酮作為治療冠心病的良藥，酸棗根可以治療失眠以及急性痢疾，酸棗樹皮有止瀉及防治皮膚燒傷、燙傷之功效[3]。近年來，英國學者在對虛弱癥患者的觀察中發現[4]，凡是連續按時吃酸棗的，其康復速度比單純服用多種維生素類的快6倍以上，因此，酸棗被證明具有防病抗衰老與養顏益壽的作用。較多研究表明，黃酮類化合物是酸棗中普遍存在的多酚類物質，隨著對其研究的深入，人們逐步發現黃酮類化合物具有抗炎、抗病毒、利膽、強心、鎮靜鎮痛、免疫調節和抗腫瘤等作用[5]，同時，酸棗多酚酚羥基中的鄰位酚極易被氧化，具有很強的抗氧化性和清除自由基的能力[6，7]。

賀蘭山野生酸棗生長在荒山野地，受有害物質污染少甚至無污染，具有色澤好、雜質少、藥用物質含量高等特點，可以作為名貴藥材。本文對賀蘭山野生酸棗中總黃酮含量進行了測定，及對提取物抗自由基活性的研究，旨在為寧夏賀蘭山地區野生酸棗資源的加工利用提供理論依據，對酸棗企業的發展和酸棗的深加工利用具有重要的指導意義。

1　材料與方法

1.1原料與儀器

1.1.1原料與試劑賀蘭山野生酸棗；蘆丁標準品（中國藥品生物制品檢定所）純度為92.5 %；無水乙醇；NaNO2、Al（NO3）3、NaOH（天津市科密歐化學試劑有限公司）分析純；DPPH 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（Alfa aesar）純度>95 %。

1.1.2主要儀器設備電熱恒溫鼓風干燥箱（101-4-S，上海躍進醫療器械廠）；紫外分光光度計（UV-1600，上海美譜達儀器有限公司）；KDM型調溫電熱套（山東省鄄城匯鑫科技有限公司）；萬分之一電子分析天平（AEU-210，日本島津）；索氏提取儀。

1.2試驗方法

1.2.1蘆丁標準曲線的繪制精密稱取蘆丁標準品10.0 mg，用60 %乙醇溶解，完全轉入50 mL容量瓶中，用同濃度的乙醇定容至刻度，搖勻，配制成濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準儲備液。精密吸取上述蘆丁標準儲備液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，分別置于25 mL容量瓶中，依次加入5 % NaNO21.25 mL，混勻放置5 min，加入10 % Al（NO3）31.25 mL，搖勻放置6 min，加入4 % NaOH 7.5 mL，再加60 %乙醇定容至刻度，搖勻，靜置10 min后，用紫外分光光度計在510 nm波長處，以0 mL管為對照，測定吸光度值，每樣平行三次測量，取平均值繪制標準曲線。

1.2.2黃酮含量的提取將酸棗洗凈去核烘干，研磨粉碎，過40目篩，各稱取5.0 g，置于索氏提取裝置中，以乙醇為溶劑提取賀蘭山野生酸棗中總黃酮。所得提取液減壓蒸餾，除去多余的醇液，轉入100 mL容量瓶中，以同濃度的乙醇定容，搖勻，提取3次，溶液待用。

在其他條件一致的情況下，采用單因素試驗，考查乙醇濃度、料液比、提取時間3個因素對總黃酮的提取效果。

1.2.3總黃酮含量的測定精密吸取4 mL樣品提取液至25 mL容量瓶中，按照1.2.1中NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法操作，用同濃度乙醇定容至刻度，搖勻，用紫外分光光度計在510 nm波長處，以0 mL管為對照，測定吸光度值，根據線性回歸方程計算黃酮濃度，按照相應稀釋倍數計算出總黃酮的含量。計算公式如下：

其中：C-由標準曲線計算出的稀釋后提取液中總黃酮濃度（mg/mL），6.25-稀釋倍數，0.1-樣品提取液體積（L），5-酸棗粉末質量（g）。

1.2.4樣品提取液DPPH自由基清除率測定精密稱取DPPH試劑25 mg，用無水乙醇溶解，定容于250 mL容量瓶中，配制成0.1 mg/mL DPPH標準溶液，避光保存。取2 mLDPPH標準液，加入無水乙醇，定容于25 mL容量瓶中，配制成DPPH工作液，避光保存。取2 mL DPPH工作液，加2 mL溶劑，在510 nm處測定其吸光度Dd。取2 mL DPPH工作液加2 mL樣品提取液，在510 nm處測其吸光度Di。取2 mL樣品提取液加2 mL溶劑，在510 nm處測其吸光度Dj。樣品提取液對DPPH自由基清除率計算公式如下：

2　結果與分析

2.1蘆丁標準曲線

以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，所得的回歸方程為y=15.025x-0.015 8，R2=0.999 1，繪制的標準曲線（見圖1）。

圖1　蘆丁標準曲線Fig.1 Rutin standard curve

2.2賀蘭山野生酸棗黃酮提取工藝

2.2.1濃度對賀蘭山野生酸棗黃酮提取的影響選擇不同濃度的溶劑按照1.2.2方法提取樣品中總黃酮，在標準曲線中查出相應的值，樣品中總黃酮含量以蘆丁的相對量表示，通過1.2.3公式計算出賀蘭山野生酸棗總黃酮含量（見表1）。

表1　濃度對黃酮含量的影響Tab.1 Effects of concentration of flavonoids content from wild jujube

結論：通過不同濃度醇回流對賀蘭山野生酸棗中黃酮的提取試驗結果發現，70 %醇回流得到黃酮含量最高，因此選擇70 %醇作為提取溶劑。

2.2.2料液比對賀蘭山野生酸棗黃酮提取的影響選擇不同的料液比按照1.2.2方法提取樣品中總黃酮，在標準曲線中查出相應的值，樣品中總黃酮含量以蘆丁的相對量表示，通過1.2.3公式計算出賀蘭山野生酸棗總黃酮含量（見表2）。

表2　料液比對黃酮含量的影響Tab.2 Effects of solid-liquid ratio of flavonoids content from wild jujube

結論：通過不同料液比對賀蘭山野生酸棗中黃酮的提取試驗結果發現，料液比為1:30提取黃酮含量最高，故選擇最佳的料液比為1:30。

2.2.3提取時間對賀蘭山野生酸棗黃酮提取的影響選擇不同的提取時間按照1.2.2方法提取樣品中總黃酮，在標準曲線中查出相應的值，樣品中總黃酮含量以蘆丁的相對量表示，通過1.2.3公式計算出賀蘭山野生酸棗總黃酮含量（見表3）。

表3　提取時間對黃酮含量的影響Tab.3 Effects of extraction time of flavonoids content from wild jujube

結論：通過不同提取時間對賀蘭山野生酸棗中黃酮的提取，試驗結果發現，隨著提取時間的增長，所得黃酮含量越高，但增加到一定程度后，黃酮含量變化不大，為了節約時間，故選擇最佳的提取時間為6 h。

2.3 DPPH自由基清除率

在最佳的條件下（溶劑：70 %醇、料液比：1：30、提取時間6 h）提取物，按照1.2.4方法做清除DPPH自由基能力的試驗，平行測定三次（見表4）。

表4　賀蘭山野生酸棗提取物對DPPH自由基清除率Tab.4 The extract in wild jujube on Helan mountain to remove DPPH free radical

3　結論

本實驗采用溶劑浸提法以乙醇為浸提劑提取賀蘭山野生酸棗中的總黃酮，并以蘆丁為標準品，通過分光光度法在510 nm處測定提取液中黃酮的含量并在510 nm處測定其抗氧化活性。單因素試驗表明，溶劑浸提法提取賀蘭山野生酸棗中黃酮類物質的最優工藝條件為：提取劑70 %乙醇，提取時間6 h，料液比1：30，此時酸棗中黃酮類物質的含量為0.490 %。提取物對DPPH自由基有較好的清除作用，清除率達81.66 %，證明賀蘭山野生酸棗有一定的抗自由基活性。

較多文獻表明，通過對金絲小棗、贊皇大棗和阜平大棗中多酚物質的研究，可以證明其具有明顯的抗氧化活性，具有十分廣闊的開發前景。同時，黃酮的提取開發成本較高，從價格低廉的野生酸棗中提取黃酮成為當今研究的熱點，對賀蘭山野生酸棗中黃酮的提取、含量的測定以及對抗氧化活性的研究，可以為寧夏賀蘭山地區野生酸棗資源的加工利用提供理論依據，對棗企業的發展和棗的深加工利用具有重要的指導意義。

參考文獻：

［1］葉卉.酸棗中多酚類物質的提取分離及其活性的研究［D］.天津科技大學，2009.

［2］楊雷，周俊義，陳海江.酸棗資源研究進展及利用前景［A］.中國園藝學會干果分會、河南省新鄭市政府.第三屆全國干果生產與科研進展學術研討會論文集［C］.中國園藝學會干果分會、河南省新鄭市政府，2003.

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［5］張艷軍.花椒黃酮和多酚含量及抗氧化活性研究［D］.西北農林科技大學，2013.

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［7］劉紅，等.不同提取方法對沙棗多酚清除自由基能力的比較研究［J］.食品科技，2010，（11）：227-230.

The extraction of flavonoid in wild jujube on Helan mountain and the determination of polyphenols anti-oxidational effects

YANG Anan1，DING Runmei2
（1.Clinical Medical School of Ningxia Medical University，Yinchuan Ningxia 750004，China；2.Basic Medical School of Ningxia Medical University，Yinchuan Ningxia 750004，China）

Abstract:Wild jujube on Helan mountain as the research object,by soxhlet extraction with different concentrations of ethanol as solvent extraction total flavonoids.And the use of single-factor test to optimize the extraction process parameters of Helan mountain wild jujube.The anti-free radical activity of the extracts was measured by using DPPH method.We found when the solid-liquid ratio was 1:30,the concentration of ethanol was 70 % and the extraction time was 6 h.The content of falconoid in the extract was 0.490 %.Extract on DPPH radical scavenging effect better, clearance rate 81.66 %,prove Helan mountain wild jujube have some anti-free radical activity.

Key words：wild jujube on Helan mountain；total flavonoids；DPPH method；anti-free radicals activity

通訊作者：丁潤梅，女（1978-），碩士研究生，副教授，分析化學，郵箱：ding_rm@163.com。

基金項目：2015年自治區大學生創新訓練計劃，項目編號：NXCX2015187。

*收稿日期：2016－01-09

DOI:10.3969/j.issn.1673-5285.2016.03.033

中圖分類號：R285

文獻標識碼：A

文章編號：1673-5285（2016）03-0127-04