抗茶樹白星病MYB轉錄因子的克隆和生物信息學分析

摘 要 白星病是貴州省茶葉生產的重要限制因素。提高貴州省茶葉品種的抗病性，對促進貴州省茶葉產量提高、品質改善具有重大的戰略和現實意義。初步分析表明：茶葉CsMYBantif為MYB類轉錄因子，受白星病菌侵染以及旱處理、鹽處理等非生物脅迫誘導表達。該基因是茶樹遺傳資源改良的重要候選基因。下一步需要揭示該基因響應白星病菌侵染的分子機理，為培育抗白星病茶樹新品種或新種質儲備基因資源。

關鍵詞 茶樹；白星病；轉錄因子；CsMYBantif

中圖分類號：Q943.2 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.35.038

我國是世界上最大的茶葉生產國，也是重要的茶葉貿易國，茶葉產業在我國國民經濟中占有重要的地位。茶白星病在我國安徽、福建、貴州、四川、江西、湖南和云南等茶葉產區均有發生。茶樹感染白星病后，新梢生長不良、芽重減輕、葉片易脫落，發病茶園一般減產10%左右，病重茶園減產50%以上，甚至片葉無收，該病已發展成為我國茶葉高產優質的重要限制因素之一。

培育和大范圍應用高抗白星病茶葉品種是遏制白星病病害、提高茶園效益的重要途徑。借助于現代分子生物學技術，通過轉基因手段與常規育種有機結合應該是破解茶葉抗白星病育種難題的新的出路。而目前，茶葉抗白星病轉基因育種的一個瓶頸是缺乏有效的抗性基因。對茶葉白星病抗性進行分子機理研究，克隆茶葉抗白星病相關基因，研究其致病/抗病機制是茶葉抗病育種的基礎和前提。

目前，茶葉抗白星病的研究還集中在生理和田間病害發生調查方面，白星病菌侵染茶樹的分子機理研究還十分薄弱。曾明森研究表明，茶白星病菌以菌絲體或分生孢子器的形式在茶樹病葉、病梢及落葉中越冬。次年春天，茶樹幼葉初展時期，白星病菌的分生孢子器便會釋放出大量分生孢子，通過風雨傳播，在濕度適宜時侵入幼嫩芽葉、新梢致病。經2～5 d潛伏期，茶樹幼嫩新葉上便會表現出病斑，病斑上又會產生分生孢子再侵染，使病害不斷擴展蔓延。若外界條件適宜，此病害便會大范圍的流行。

茶葉白星病屬低溫高濕型病害，當平均溫度約為20 ℃，相對濕度達80%時，最利于白星病害發生。在適合發病的季節，若連續3～5 d陰雨，白星病便會爆發。此病發生期早，流行時間長。一般發生始期為3月下旬，流行期從4月上旬至6月上旬。貴州省高山茶園由于多霧、陰濕、低溫，故白星病發生尤其頻繁，為害劇烈。

克隆茶葉抗病基因，研究其抗病機制是茶葉抗白星病育種的基礎和前提。在長期的生物進化過程中，植物自身已經發展了多種通過調節自身生理和代謝變化來抵御病菌侵染的機制。其中的一個重要機制就是通過病菌侵染信號轉導來啟動抗病響應基因的表達。在病菌侵染信號轉導途徑中，轉錄因子由于能夠調節多個響應功能基因的表達而備受關注。在擬南芥基因組已發現1 600多個轉錄因子，約為基因總數的6%。MYB轉錄因子是其中數目最多的一類。MYB基因家族參與植物的各種發育生理過程，如器官形態建成、細胞周期、信號傳導、次生代謝、生物和非生物脅迫應答以及ABA的敏感性等。

本研究利用茶樹已有的基因組序列信息，從貴州優良、特異品種遵義毛峰中克隆到一個新的MYB轉錄因子CsMYBantif。實時定量表達分析發現CsMYBantif基因可能在茶葉生物和非生物脅迫反應中起重要調控作用，是茶樹抗逆性遺傳改良的重要候選基因。因此，有必要研究清楚CsMYBantif轉錄因子的功能及其在白星病菌脅迫響應中的調控網絡，為茶樹的抗病育種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 CsMYBantif基因克隆

將遵義毛峰幼苗種于花盆中，在25 ℃培養室中培養。選取生長一致幼苗的根、莖、葉，用于不同組織的表達特性分析；選取長勢一致的幼苗，取幼嫩葉片部位用于RNA提取和表達分析。利用Trizol（Invitrogen）法提取根、莖和葉組織的總RNA，利用定量PCR分析CsMYBantif的時空表達特性。

1.2 CsMYBantif生物信息學分析

基因序列克隆后，利用orf finder找出對應氨基酸序列。系統進化樹構建使用MEGA6.0軟件。基因序列的結構分析使用在線軟件GSDS（http：//gsds1.cbi.pku.edu.cn/）。氨基酸序列的結構特征分析使用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線工具。

2 結果與分析

2.1 茶葉CsMYBantif基因克隆

根據測序結果設計引物，在遵義毛峰cDNA中擴增出目的基因片段，如圖1所示，條帶大小在900～1 000 bp。克隆測序后顯示該基因編碼序列（Coding sequence，CDS）為696 bp，可編碼231個氨基酸，所編碼氨基酸序列的序列為：MAPRVNFPQRTRTQFLPSSGVKRRMPSPPQVSASSESSDGFPPEPPMAAANGKRRREVEEEVNGADSGHRTQGLRELAQAIRRFGEVYERVELAKREQELRMERDRLEAARELEDQRVQFFLKMQMELSKANNAGASAAAAAVGAVATAIAAADGNGTRRTAMATDVGTSSNHHVRYRFKDSRHCHAAPQQPQHQYNENNAAEAARGTGNGSDTDNKEDEDEAEDEEDESQ。

2.2 CsMYBantif響應生物脅迫和非生物脅迫

選取生長一致的幼苗，分別進行培養液（CK）、PEG、NaCl、白星病菌侵染、4 ℃低溫及H202處理后，通過實時定量PCR檢測CsMYBantif在茶樹葉片中的表達變化情況，如圖2所示。結果表明，在白星病菌液侵染后，CsMYBantif在葉中的表達較對照極顯著增強，為對照的45倍（P<0.000 1），而在PEG、NaCl、低溫和H202處理后，CsMYBantif在葉中的表達與對照相比也有明顯增加，說明在葉中響應生物脅迫和非生物脅迫方面，CsMYBantif具有重要的功能。

3 結論

茶白星病是貴州省茶葉生產的重要限制因素。茶樹感染白星病后，產量會嚴重減少，質量急劇下降。茶白星病是我國茶葉高產優質的重要限制因素。本文利用茶樹已有的基因組序列信息，從貴州優良、特異品種遵義毛峰中克隆到一個新的MYB轉錄因子CsMYBantif。實時定量表達分析發現CsMYBantif基因在白星病菌侵染后表達顯著上調，可能在茶葉生物和非生物脅迫反應中起重要調控作用，是茶樹抗逆性遺傳改良的重要候選基因。

下一步有必要研究清楚CsMYBantif轉錄因子的功能及其在白星病菌脅迫響應中的調控網絡，為茶樹的抗病育種提供基因資源。

（責任編輯：劉昀）