飼料中霉菌毒素脫毒方法的評估

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）和煙曲霉毒素的各種生物標記物可用來證明兩種酶制劑降解玉米赤霉烯酮和煙曲霉毒素的體內功效和兩種木質纖維素吸附劑無法吸附豬胃腸道中的玉米赤霉烯酮。

1 生物標記物

體外試驗是開發霉菌毒素脫毒劑的關鍵步驟。然而，為了評估霉菌毒素脫毒劑在動物體內的功效，體內研究是必需的。評估霉菌毒素暴露和脫毒程度的最適指標，是霉菌毒素的生物標記物。生物標記物和生物基質的選擇取決于很多因素，如日糧中霉菌毒素的濃度，暴露時間長度，霉菌毒素本身及其脫毒產品的吸收、代謝和排泄，還取決于霉菌毒素改變動物代謝過程和對動物物種影響的能力。非創傷性的生物標記最合適，選擇生物基質的其他標準是霉菌毒素滅活的機理。本文將著重介紹用來研究豬胃腸道中鐮刀菌屬霉菌毒素（玉米赤霉烯酮）和煙曲霉毒素B1+B2（Fumonisins B1+B2，FB1+FB2，FUMs）失活的生物標記物。

2 尿液肌酸酐作為生物標記物

飼料中添加霉菌毒素脫毒劑的主要目的是降低霉菌毒素的生物利用率。此目標可以通過使用與吸附劑發生不可逆吸附或利用酶或微生物降解使毒素失活來實現。評估這兩種類型飼料添加劑功效最直接的方法是監測效應生物標記物的變化（然而，這只適用于某些霉菌毒素）或者比較正對照組和試驗組中吸收的霉菌毒素母體及其天然代謝物的總摩爾濃度。對豬來講，測定被吸收化合物總濃度的兩種可能基質是尿液和血清。由于尿液樣本水分含量的不同，將總濃度（一種排泄速度相對恒定的生物標志物）為參照進行標準化是進行可靠比較的關鍵。

3 霉菌毒素代謝物作為其他生物標記物

吸附劑的適用性取決于對霉菌毒素母體生物利用率的降低程度，而根據動物腸道中酶或微生物的降解，酶或微生物降解類飼料添加劑可作為測試飼料添加劑適用性的其他生物標記物。較難被吸收的霉菌毒素降解產物以及通過膽汁排泄部分被運送到胃腸道中的霉菌毒素降解作用，都可以通過分析糞便中霉菌毒素代謝產物組成來進行評估。 表1列出了測定吸附劑、酶和微生物在豬胃腸道中滅活玉米赤霉烯酮和煙曲霉毒素功效的可能生物標記物。

玉米赤霉烯酮很容易被豬的胃腸道吸收，一部分降解成為α-玉米赤霉醇（α-Zeranol，α-ZEL）。玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉醇大部分可以發生葡糖醛酸化反應，并通過尿液排出。因此，可以根據尿中ZEN代謝物的總摩爾濃度來選擇檢測飼料添加劑功效的生物標記物，總摩爾濃度可以通過直接分析葡糖醛酸苷態的ZEN濃度或分析經β-葡糖醛酸酶水解后的ZEN濃度獲得。與玉米赤霉烯酮不同，煙曲霉毒素不易被豬的胃腸道吸收，從而導致糞便中煙曲霉毒素濃度很高，而血液和尿液中濃度很低。因此，糞便中煙曲霉毒素的組成狀況是最容易檢測的毒素暴露生物標記物。然而，這并不能準確反映吸收時煙曲霉毒素的組成狀況，因為未被吸收的煙曲霉毒素在通過糞便排出前可能會被進一步轉化。此外，檢測糞便中煙曲霉毒素的濃度不適用于評定吸附劑的功效。然而，與玉米赤霉烯酮相比，效應生物標記物的存在簡化了煙曲霉毒素的體內試驗研究：煙曲霉毒素暴露會擾亂鞘脂類代謝，導致血液中鞘氨基醇堿鞘胺醇（Sphinganine，Sa）對二氫鞘氨醇（Sphingosine，So）的比例發生變化。然而Sa/So比例的升高取決于煙曲霉毒素的濃度和暴露的時間長度。因此，通常將作為暴露生物標記物的糞便中煙曲霉毒素組成與作為效應生物標記物的Sa/So比例結合起來，用來評估煙曲霉毒素脫毒劑類飼料添加劑的功效。

4 生物標記方法在動物試驗中的應用

霉菌毒素脫毒劑體內功效的可靠研究需要精心設計動物試驗，包括1個飼喂基礎日糧的負對照組，1個被目標霉菌毒素污染的正對照組以及1個或多個添加飼料添加劑的受霉菌毒素污染的試驗組日糧。此外，每個處理組的動物要足夠多，這樣才能消除動物個體差異對霉菌毒素母體的代謝和降解造成的影響。

利用生物標記物研究ZEN的酶解效應的一個實例，是評估能在體外將ZEN轉化為水解玉米赤霉烯酮（Hydrolyzed Zearalenone，HZEN）的內酯水解酶的體內功效（圖1）。試驗豬采食含500 μg/kg ZEN的日糧（正對照）或添加了內酯水解酶的相同日糧4 d，然后收集尿樣和糞樣。處理組動物尿液中未檢出ZEN和ZEN-葡糖苷酸，再加上檢出HZEN、脫羧水解玉米赤霉烯酮（HZEN自發脫羧的產物）以及這些物質的葡糖苷酸代謝物，這就證實了具有在豬胃腸道中把ZEN水解為HZEN的能力。糞便樣本分析發現，試驗組的一些豬糞便含有微量的ZEN，但未檢測到任何葡糖醛酸化態物質，從另一個方面證實了尿樣分析的結果。

與ZEN不同，煙曲霉毒素很難被豬的胃腸道吸收，這使得糞便中的煙曲霉毒素濃度最高，而血液和尿液中濃度較低。

另一個試驗評估了之前在體外試驗中顯示90%以上吸收率的兩種木質纖維素吸附劑在豬體內的功效。將尿液中ZEN代謝物的總摩爾濃度用作生物標記物。由于日糧中ZEN的含量較低——僅150 μg/kg，ZEN-葡糖苷酸是尿液中唯一含量高于該檢測線的代謝產物。按肌酸酐含量進行標準化后，ZEN正對照組和兩個木質纖維素吸附劑處理組的試驗豬尿液中ZEN-葡糖苷酸濃度沒有顯著差異，表明木質纖維素吸附劑在本試驗中不能阻止玉米赤霉烯酮的吸收。

5 測定煙曲霉毒素酯酶效果的試驗

最后，進行了兩個豬飼養試驗，以此研究煙曲霉毒素酶（以下稱為飼料添加劑）效果和最適添加量；煙曲霉毒素酶是一種羧酸酯酶，旨在將FB1分解為毒性較小的水解衍生物（Hydrolyzed Fumonisin B1，HFB1）（圖1）。

在第一個試驗中，每個處理6頭豬，試驗日糧為：正對照日糧（日糧的FB1、FB2含量分別為5 mg/kg和1 mg/kg）、處理日糧（日糧相同但加入飼料添加劑）、或負對照日糧（未被污染的日糧），試驗為期5周。只采集血漿樣本，并且只檢測試驗豬血清Sa/So比值。連續飼喂3周后，正對照組的試驗豬血清Sa/So比值顯著增加。在試驗結束時，正對照組的平均Sa/So比值從原來的0.12進一步增加至0.85，然而負對照組和添加劑組則保持不變。

在第二個試驗中，日糧FB1+FB2濃度增加到（30+9） mg/kg。試驗豬分入1個日糧受煙曲霉毒素污染的正對照組、4個污染日糧及加有不同濃度添加劑的處理組以及1個日糧未被煙曲霉毒素污染的負對照組。本試驗檢測了血清Sa/So比值、糞便和尿液的煙曲霉毒素濃度。僅一周后，正對照組的試驗豬血清Sa/So比值從0.20顯著提高到0.92，而負對照組和含有添加劑的處理組試驗豬都沒有顯著變化。通過分析糞便樣本證實，血清Sa/So比值的提高與飼料添加劑的濃度有著間接的相關性。隨著飼料添加劑濃度的增加，糞便中FB1和FB2的濃度逐漸降低，然而HFB1和HFB2的濃度卻逐漸增加。和預想的一樣，與糞便樣相比，尿液中煙曲霉毒素稍微偏向于非水解態，但是從尿液樣本中可明顯地發現，隨著添加劑添加量的增加，尿液中的FB1和FB2的濃度逐漸降低。原題名：Assessing mycotoxin detoxification methods in feed（英文）

原作者：Heidi Schwartz-Zimmermann[自然資源與生命科學大學（BOKU），維也納]