響應(yīng)面優(yōu)化雙孢菇預(yù)煮液酶解工藝研究

摘要：以游離α-氨基氮為指標(biāo)，對(duì)比了中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶對(duì)雙孢菇（Agaricus bisporus）預(yù)煮液的酶解效果，并采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化了中性蛋白酶的酶解工藝。結(jié)果表明，中性蛋白酶酶解效果優(yōu)于風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶，其最優(yōu)工藝為添加量0.41%，pH 6.5，55 ℃酶解2.95 h，在此條件下，游離α-氨基氮為419.6 mg/L。

關(guān)鍵詞：雙孢菇（Agaricus bisporus）；預(yù)煮液；酶解；響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)：S646.1+9；TS264 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）22-5926-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.049

Optimization of the Enzymatic Hydrolysis Process of Blanching Liquid from Agaricus bisporus by Response Surface Analysis

XUE Shu-jing1，LI Lu1，YANG De1，GUAN Jian1，DUAN Xiu-hui2，WANG Xiao-li1，GAO Hong1，CHENG Wei1

（1.Institute for Processing of Farm Products and Nuclear-Agricultural Technology，Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064，China； 2.College of Food Science Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070，China）

雙孢菇（Agaicus bisporus）又稱蘑菇、白蘑菇，屬傘菌目蘑菇科蘑菇屬[1]，是世界上食用和栽培量最高的菇種。2013年中國(guó)年產(chǎn)量為2 377 327.12 t。雙孢菇味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、其營(yíng)養(yǎng)指數(shù)、生物價(jià)、氨基酸評(píng)分、必需氨基酸指數(shù)等都比較高，接近于肉類和牛奶。除了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值外，保健功能也受到關(guān)注，國(guó)內(nèi)已制成“健肝片”用以治療肝炎，此外還具有抗癌、降血壓等多種功能[2]。雙孢菇采收季節(jié)性強(qiáng)，采后極易褐變、開傘、失水、腐敗等。目前最為普遍的加工方式是制罐。而預(yù)煮工藝是生產(chǎn)罐頭必備的生產(chǎn)工序，在預(yù)煮工序中，大量的營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)溶于預(yù)煮液中。鄭桂春等[3]發(fā)現(xiàn)平菇殺青后干物質(zhì)損失高達(dá)23.45%。在實(shí)際生產(chǎn)中，大量食用菌預(yù)煮液往往當(dāng)做廢水排出，不僅造成資源浪費(fèi)，也會(huì)一定程度上帶來環(huán)境污染。因此，預(yù)煮液的綜合開發(fā)利用問題逐漸引起人們的注意。食用菌預(yù)煮液的開發(fā)主要是利用食用菌的感覺功能（含風(fēng)味物質(zhì)與呈味物質(zhì)等成分）[4]，加工成醬油、食醋、浸膏等產(chǎn)品[5-8]。研究發(fā)現(xiàn)食用菌中構(gòu)成風(fēng)味的鮮味主要來自不揮發(fā)的氨基酸、肽和核苷酸類含氮化合物[9]。因此，本研究以游離α-氨基氮為指標(biāo)，利用生物酶水解技術(shù)，增加風(fēng)味物質(zhì)溶出，從而提高其加工產(chǎn)品品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雙孢菇去雜清洗，適度切片。添加0.1%的檸檬酸于冷水（雙孢菇∶水=1∶1.2）中，待水煮沸后分批加入菇片，10 min/批。預(yù)煮結(jié)束后，撈出菇體。適度冷卻后用3～4層紗布過濾，調(diào)節(jié)濾液可溶性固形物含量至2%（視情況加水稀釋或加熱濃縮），濾液冷凍備用。

木瓜蛋白酶，Sigma試劑公司；中性蛋白酶，諾維信（天津）酶制劑公司；風(fēng)味蛋白酶，諾維信（天津）酶制劑公司，3種酶活見表1。

1.2 方法

1.2.1 雙孢菇預(yù)煮液蛋白酶處理?xiàng)l件研究 取一定量的雙孢菇預(yù)煮液，過濾后，分別控制pH、溫度、蛋白酶添加量、酶解時(shí)間。酶解結(jié)束后，水解液在90 ℃下加熱滅酶15 min后，將酶解液稀釋100倍后，測(cè)定游離α-氨基氮含量。

1.2.2 游離α-氨基氮測(cè)定 采用茚三酮法[9]。取5支試管，其中3支各加2 mL甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（α-氨基氮2 μg/mL），一支加2 mL試樣稀釋液，另一支加2 mL水作空白，然后在各管中加1 mL顯色劑，搖勻，并在管口放一玻璃球，在沸水浴上加熱16 min，取出，立即在20 ℃水浴中冷卻20 min，加5 mL稀釋液搖勻，在30 min內(nèi)于570 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。

游離α-氨基氮=（試管的吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管平均吸光度）×4×（1/2）×試樣稀釋倍數(shù)

1.2.3 最佳蛋白酶的選擇 通過單因素試驗(yàn)確定木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶的最適酶解條件（pH、時(shí)間、添加量、溫度），分別在3種蛋白酶最佳酶解條件下進(jìn)行酶解后對(duì)比酶解效果，篩選出酶解效果最好的蛋白酶。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化中性蛋白酶酶解條件 在以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以中性蛋白酶添加量、pH、酶解時(shí)間為因素，各因素?cái)M定3個(gè)水平，以游離α-氨基氮為指標(biāo)，采用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，得到中性蛋白酶的最優(yōu)酶解條件。具體響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素與水平見表2。數(shù)據(jù)處理采用Excel 2007，Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙孢菇預(yù)煮液最適蛋白酶的選擇研究

在食用菌加工中，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶是比較常見的蛋白酶類，而風(fēng)味蛋白酶是一種混合酶，它同時(shí)包括內(nèi)切酶和外切酶，可將疏水氨基酸從蛋白質(zhì)末端有效地切除，使末端疏水氨基酸游離，以降低苦味等不良風(fēng)味[10]。故本研究擬從中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶3種蛋白酶進(jìn)行篩選。

每一種酶都有最適的酶解時(shí)間、pH、溫度和添加量。通過試驗(yàn)，以游離α-氨基氮為指標(biāo)，確定3種蛋白酶的酶解條件（圖1）。圖1（a）顯示了木瓜蛋白酶的酶解結(jié)果：當(dāng)酶解初始pH 6.5時(shí)，酶解效果最好；酶解時(shí)間為120、180 min時(shí)游離α-氨基氮含量均較高，且相差不大，考慮試驗(yàn)高效性，選擇120 min作為最佳酶解時(shí)間；添加量達(dá)到0.2%后，游離α-氨基氮隨添加量的增加升高不明顯，故添加量為0.2%時(shí)即為最佳；隨著溫度上升，游離α-氨基氮不斷增加，當(dāng)溫度為55 ℃時(shí)，酶解效果最好。所以木瓜蛋白酶的最佳酶解條件為初始pH 6.5、添加量0.2%、55 ℃酶解120 min。圖1（b）顯示了中性蛋白酶的酶解結(jié)果：隨著初始pH上升，游離α-氨基氮有所增加，當(dāng)pH 6.5時(shí)，游離α-氨基氮達(dá)到峰值，之后隨著pH升高，游離α-氨基氮含量逐漸減少；酶解時(shí)間為150 min時(shí)游離α-氨基氮達(dá)到峰值，酶解效果最好；游離α-氨基氮含量隨著添加量變化緩慢增加，增幅不明顯，考慮經(jīng)濟(jì)性，選擇0.3%為最佳添加量；隨著溫度上升，游離α-氨基氮不斷增加，當(dāng)溫度為55 ℃時(shí)，酶解效果最好。所以木瓜蛋白酶的最佳酶解條件為初始pH 6.5、添加量0.3%、55 ℃酶解150 min。圖1（c）顯示了風(fēng)味蛋白酶的酶解結(jié)果：當(dāng)pH 6.0時(shí)，游離α-氨基氮達(dá)到峰值，酶解效果最好；隨著酶解時(shí)間增加，游離α-氨基氮含量逐漸上升，并在180 min時(shí)含量最高；游離α-氨基氮含量隨著添加量變化緩慢增加，在添加量達(dá)0.4%時(shí)酶解效果最好；隨著溫度上升，游離α-氨基氮不斷緩慢降低，故45 ℃為最佳酶解溫度。所以風(fēng)味蛋白酶的最佳酶解條件為初始pH 6.0、添加量0.4%、45 ℃酶解180 min。

分別在3種蛋白酶最佳酶解條件下進(jìn)行酶解，其酶解效果對(duì)比結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，中性蛋白酶優(yōu)于風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶，故以中性蛋白酶進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 中性蛋白酶酶解條件響應(yīng)面優(yōu)化

為優(yōu)化單因素試驗(yàn)得到的工藝條件，在55 ℃溫度下，以中性蛋白酶酶解條件添加量、pH、酶解時(shí)間為因素，游離α-氨基氮為指標(biāo)，采用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表3。應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得自變量與游離α-氨基氮（Y）的回歸方程：Y=421.34+2.91A-1.85B-3.69C-10.47AB-25.57BC-28.17A2-44.24B2-18.52C2（R2=0.948 6），結(jié)果如表4所示。從表4可以看出，該回歸模型P為0.000 2，回歸模型達(dá)到極顯著；失擬項(xiàng)為0.023 3，達(dá)到顯著水平；回歸模型因變量和自變量之間的關(guān)系顯著（R2=0.948 6），說明模型的擬合程度較好，試驗(yàn)誤差較小；影響中性蛋白酶酶解雙孢菇預(yù)煮液效果的酶解條件中，影響游離α-氨基氮含量的顯著性關(guān)系為酶解時(shí)間>添加量>pH；考慮因素之間的交互作用，pH和酶解時(shí)間之間存在交互作用，達(dá)到顯著水平。

三維空間的響應(yīng)面圖能比較形象的反映各因素之間的交互作用。為進(jìn)一步反映兩變量交互作用對(duì)游離α-氨基氮影響的顯著性，也作了相應(yīng)的等高線圖，圖中橢圓形則表示顯著，而圓形表示不顯著[11]。中性蛋白酶酶解雙孢菇預(yù)煮液效果的酶解條件中添加量、pH和酶解時(shí)間之間的交互作用對(duì)游離α-氨基氮含量的影響如圖3所示。

從圖3a可以看出，pH和添加量對(duì)游離α-氨基氮含量的影響均成拋物線，即隨著pH和添加量的同時(shí)增大，游離α-氨基氮含量先增大后降低，因此酶解時(shí)適當(dāng)增加pH和添加量可以提高游離α-氨基氮含量。從圖3b可知，等高線圖呈橢圓形，說明pH和酶解時(shí)間之間的交互作用對(duì)游離α-氨基氮含量的影響顯著，這與和方差分析顯示結(jié)果一致。只有在添加量、pH和酶解時(shí)間適宜的情況下，中性蛋白酶才能發(fā)揮最佳的酶解效果。

為精確計(jì)算出中性蛋白酶最佳酶解條件，利用回歸方程對(duì)各自變量（A、B、C）求極值，得到極值點(diǎn)為A=0.051，B=0.003，C=-0.101，即添加量0.41%，pH 6.5，酶解時(shí)間2.95 h。在此最優(yōu)條件下，游離α-氨基氮為421.6 mg/L。經(jīng)過3次驗(yàn)證試驗(yàn)后，得到平均游離α-氨基氮為419.6 mg/L，與理論值相符。說明該回歸模型能較好地將中性蛋白酶酶解產(chǎn)生游離α-氨基氮的含量預(yù)測(cè)出來，優(yōu)化得到的酶解條件是準(zhǔn)確可靠的，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

以游離α-氨基氮為指標(biāo)，以蛋白酶對(duì)雙孢菇預(yù)煮液進(jìn)行酶解。試驗(yàn)從3種酶（木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶）中篩選出了中性蛋白酶，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化了酶解工藝，其最優(yōu)工藝為添加量0.41%，pH 6.5，55 ℃酶解2.95 h，在此條件下，游離α-氨基氮為419.6 mg/L。

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Abstract： With free α-amino nitrogen as index， the enzymatic hydrolysis effects of neutral protease， papain and flavour protease on blanching liquid of Agaricus bisporus were compared， and the enzymatic hydrolysis process of neutral protease was optimized by Box-Behnken response surface experiment. The results showed that， the enzymatic hydrolysis effect of neutral protease was better than that of flavour protease and papain. The optimal conditions were an additive amount of 0.41%， t=2.95 h， pH=6.5， T=55 ℃. Under the conditions， the content of free α-amino nitrogen was 419.6 mg/L.

Key words： Agaricus bisporus； blanching liquid； enzymatic hydrolysis； response surface experiment