糞腸球菌和枯草芽孢桿菌的體外評價研究

摘要：測定了糞腸球菌（Enterococcus Faecalis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis）對致病性大腸桿菌O54、霍亂沙門氏菌A72及正常菌嗜酸乳酸桿菌CICC6075生長的影響。結果表明，糞腸球菌和枯草芽孢桿菌均可較好的抑制大腸桿菌和沙門氏菌的生長；糞腸球菌對嗜酸乳酸桿菌起到較好的促生長作用；枯草芽孢桿菌與嗜酸乳酸桿菌混合培養的前35 h，對嗜酸乳酸桿菌有一定的抑制作用，但35 h以后則對其有較好的促生長作用。

關鍵詞：糞腸球菌；枯草芽孢桿菌；混合培養；體外評價

中圖分類號：S816.7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）23-6200-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.050

Abstract：The effect of E. faecalis， B. subtilis on the growth of Escherichia coli O54（E. coli）， Salmonella choleraesuis A72 （S. choleraesuis） and normal bacterial Lactobacillus acidophilus were studied in this research. The results showed that the growth of E. Coli and S. choleraesuis could be well inhibited by E. faecalis and B. subtilis. E. faecalis could promote the growth of L. acidophilus. However， L. acidophilus could be inhibited by B. subtilis in the pre-35h of mixed culture， and then， they could be promoted growth well.

Key words：E. faecalis； B. subtilis； mixed culture； vitro evaluation

益生菌制劑又名促生素，活菌制劑，益生素。益生素由美國學者Parker于1974首次提出，是與抗生素相對應的新概念，用來表示給動物飼用的微生態制劑，它可以直接飼喂動物并通過調節動物腸道微生態平衡達到預防和治療疾病，促進動物生長以及提高飼料報酬的活性微生物，從而調整體內微生態平衡[1，2]，有的益生菌制劑還含益生菌在生長過程中產生的代謝產物[3]。某些益生菌不但可以提高飼料轉化率和畜禽的生產性能，而且對改善動物健康狀況，降低畜禽產品中膽固醇的含量有著很好的作用。此外，微生態制劑可顯著減少畜牧生產過程中對環境造成的污染[4]。

乳酸菌和芽孢桿菌能產生多種細菌素，其中大部分能夠抑制或殺滅革蘭氏陽性菌，另外的極少數則對革蘭氏陰性菌和真菌有較好抑制或殺死作用。因此，當治療革蘭氏陰性菌導致的疾病時，篩選能夠抑制革蘭氏陰性細菌的益生菌具有非常重要的應用價值。本試驗通過益生菌和致病菌及有益菌的聯合培養，建立細菌聯合培養時的生長曲線，探討糞腸球菌和枯草芽孢桿菌對致病性細菌大腸桿菌O54、霍亂沙門氏菌A72以及腸道正常菌嗜酸乳酸桿菌CICC6075生長繁殖的影響，在體外確證這兩種菌在臨床應用上的價值。

1 材料與方法

1.1 試劑、藥品

胰蛋白胨和酵母提取物為英國OXOID公司產品；TSA和M-H肉湯為英國BD公司產品；葡萄糖購自廣東光華化學廠有限公司（批號：20070528）；氯化鈉（分析純，批號：F20070726），二甲亞砜（分析純，批號：T20080229），均購自國藥集團化學試劑有限公司；SS瓊脂培養基（批號：20090317-01），伊紅美藍瓊脂（EMB）培養基（批號：20090203-02），均由杭州微生物試劑有限公司提供；乳桿菌選擇性培養基（LBS，批號：090504），由上海盛思生化科技有限公司提供。

1.2 試驗菌株

枯草芽孢桿菌與糞腸球菌，由滄州興業生物技術有限公司提供；大腸桿菌O54，霍亂沙門氏菌A72由武漢工業學院飼料科學系提供；嗜酸乳酸桿菌CICC6075，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC29213由華中農業大學農業微生物國家重點實驗室提供。

1.3 細菌的計數方法

本試驗采用較為常用的平板活菌計數法，其原理是將待測菌液經適當稀釋，涂布在相應的無菌瓊脂平板上，置于適宜的條件下培養一定時間，經過培養后在平板上形成肉眼可見的菌落，統計菌落數，根據稀釋倍數和取樣量計算出原始菌液濃度[5]。

1.4 糞腸球菌和枯草芽孢桿菌繁殖速率的測定方法

首先將復活的菌液1 mL接種到9 mL的滅菌TSB培養基中，混勻后立即開始活菌計數，所測得的菌液濃度為X1，剩余的9 mL菌液置于37 ℃，180 r/min條件下水浴恒溫振蕩器中培養，計時為T1，培養至時間T2后取出1 mL立即開始活菌計數，所測得的菌液濃度為X2。由于細菌是以二等分分裂法繁殖的，因此細菌的濃度滿足關系式：X2=2nX1，則n=3.31（lgX2-lgX1），世代時間G=（T2-T1）×60/[3.31（lgX2-lgX1）]。（G表示世代周期，n表示細菌繁殖的次數）。

2 結果與分析

2.1 糞腸球菌與枯草芽孢桿菌的世代時間測定結果

接種糞腸球菌時所測得菌懸液濃度X1為3.8×104，培養時間約為5 h，此時測得的菌懸液濃度X2為2.3×108。由公式G=（T2-T1）×60/[3.31（lgX2-lgX1）]算得糞腸球菌的世代時間G=23.9 min。

接種枯草芽孢桿菌時所測得菌懸液濃度X1為7.2×104，培養時間約為6 h，此時測得的菌懸液濃度X2為3.5×108。由公式G=（T2-T1）×60/[3.31（lgX2-lgX1）]算得枯草芽孢桿菌的世代時間G=29.4 min。

2.2 飼用益生菌對致病菌和腸道正常菌生長繁殖的影響

2.2.1 糞腸球菌對大腸桿菌O54、霍亂沙門氏菌A72及嗜酸乳酸桿菌CICC6075生長繁殖的影響 由圖1可知，從第6 h開始，混合培養體系里的大腸桿菌O54濃度要顯著低于其單獨培養時的濃度，糞腸球菌對大腸桿菌O54的拮抗作用在12～48 h達到頂峰，后面各時間點測得的菌懸液濃度也存在較大差異，據統計學檢驗，差異極顯著（P<0.01）。由此可以推斷出，當大腸桿菌O54和枯草芽孢桿菌在一個混合體系中共同存在時，枯草芽孢桿菌對大腸桿菌O54的生長繁殖具有較好的抑制作用，該株枯草芽孢桿菌具有較好的益生作用。

2.2.2 糞腸球菌對霍亂沙門氏菌A72生長繁殖的影響 由圖2可知，從第6 h開始，混合培養體系里霍亂沙門氏菌A72的菌懸液濃度要顯著低于其單獨培養時的濃度，60 h后其濃度呈急劇下降的趨勢，6到60 h的階段各時間點測得的數目也呈顯著差異。各個時間點的菌懸液濃度經統計學檢驗，差異極顯著（P<0.01）。由此可以推斷出，當霍亂沙門氏菌A72和糞腸球菌在一個混合培養體系中，在適宜條件下共同培養時，糞腸球菌對霍亂沙門氏菌A72的生長具有較好的抑制作用，該株糞腸球菌具有很好的益生作用。

2.2.3 糞腸球菌對嗜酸乳酸桿菌CICC6075生長的影響 由圖3可知，除了第30 h，其他混和培養組的嗜酸乳酸桿菌CICC6075數目就顯著比單獨培養組的乳酸桿菌數目多，統計學結果表明，各時間點的細菌濃度差異極顯著（P<0.01），這表明，糞腸球菌對嗜酸乳酸桿菌CICC6075具有較好的促生長作用。

2.2.4 枯草芽孢桿菌對大腸桿菌O54生長繁殖影響的試驗結果 由圖4可知，從第6 h開始，混合培養體系里的大腸桿菌O54濃度要顯著低于其單獨培養時的濃度，后面各時間點測得的菌懸液濃度也有很大差別，據統計學檢驗，差異極顯著（P<0.01）。由此可以看出，當大腸桿菌O54和枯草芽孢桿菌在一個混合體系中共同培養時，枯草芽孢桿菌對大腸桿菌O54具有較好的抑制作用，該株枯草芽孢桿菌具有優良的益生作用。

2.4.5 枯草芽孢桿菌對霍亂沙門氏菌A72生長繁殖影響的試驗結果 由圖5可知，從第6 h開始，混合培養體系里的霍亂沙門氏菌A72的濃度要顯著低于霍亂沙門氏菌A72單獨培養時的濃度，60 h后霍亂沙門氏菌A72的濃度呈急劇下降的趨勢，6～60 h的階段各時間點測得的菌懸液濃度較對照組也明顯偏低。各個時間點的濃度經統計學檢驗，差異極顯著（P<0.01）。由此可以看出，當霍亂沙門氏菌A72和枯草芽孢桿菌在一個混合體系中，在適宜條件下共同培養時，枯草芽孢桿菌對霍亂沙門氏菌A72的生長繁殖具有較好的抑制作用，證明該株枯草芽孢桿菌具有優良的益生作用。

2.4.6 枯草芽孢桿菌對嗜酸乳酸桿菌CICC6075生長影響的試驗結果 由圖6可知，在0～5 h階段，嗜酸乳酸桿菌CICC6075單獨培養和混合培養菌懸液濃度非常接近，5～35 h這段時間內，嗜酸乳酸桿菌CICC6075混合培養時的菌懸液濃度較單獨培養時小，且差異極顯著（P<0.01），但35 h以后混合培養的乳酸桿菌開始迅速大量繁殖，數目迅速增多，到40 h左右菌懸液濃度已經超過了單獨培養時的菌懸液濃度，由此可以推斷出在生長后期枯草芽孢桿菌對嗜酸乳酸桿菌CICC6075具有較強的促生長作用。

3 討論

試驗結果表明，糞腸球菌和枯草芽孢桿菌對致病性大腸桿菌O54和霍亂沙門氏菌A72有較強的拮抗作用，與對照組相比一般抑制率可達90%以上，對嗜酸乳酸桿菌CICC6075的生長可起到促進作用。該結果在動物活體試驗上也得到了驗證，易中華[6]用枯草芽孢桿菌和寡聚糖配伍使用，結果表明，它們能顯著增加肉雞盲腸中乳酸桿菌的數量，減少致病性大腸桿菌的數量；閆風蘭等[7]通過試驗發現兩種不同枯草芽孢桿菌均能增加肉雞腸道中乳酸桿菌的數量；張璐[8]研究發現枯草芽孢桿菌可顯著降低14、21日齡肉雞盲腸中大腸桿菌的數量。薛勝平等[9]研究發現糞腸球菌對大腸桿菌、沙門氏菌的抑制作用分別達到5 000倍、8倍。而王鋰韞等[10]從酸馬奶酒中分離出來的糞腸球菌對大腸桿菌幾乎沒有抑制作用。這可能是由于菌株的來源不同導致細菌的特性有一定差別。

糞腸球菌被認為是一種條件致病菌，在人的免疫力低下或有嚴重通常導致尿路感染、心內膜炎、腹膜炎、傷口感染等疾病[11，12]，但在一般情況下對人體和動物是沒有危害的的，屬于人和動物體內的常在菌。枯草芽孢桿菌是一種較為安全的細菌，不會對人和動物造成危害。本試驗中，糞腸球菌和枯草芽孢桿菌對致病菌的抑制作用可能與它們強大的細菌素分泌功能有關，一些學者研究發現糞腸球菌E.faecalis RJ-Ⅱ、E.faecalis LMG可以產生如細菌素Enterocin RJ-Ⅱ和Enterolysin A之類的細菌素[13，14]，這些代謝性產物可能對致病性的大腸桿菌和沙門氏菌有較好的抑制生長作用。枯草芽孢桿菌通常被認為是一種非致病菌，可以產生如肽類的抗生素枯草菌素和伊枯草菌素之類的細菌素[15]，這些物質可能對大腸桿菌和沙門氏菌有較好的抑制作用。

通過試驗發現糞腸球菌和枯草芽孢桿菌對大腸桿菌O54、霍亂沙門氏菌A72生長的抑制作用主要表現在混合培養6 h以后的階段，這說明只有當糞腸球菌和枯草芽孢桿菌達到較大的菌懸液濃度時且與大腸桿菌O54和霍亂沙門氏菌A72共存于同一培養體系時才具有較好的益生效果。

參考文獻：

[1] 楊承劍，黃興國.微生態制劑及其在畜牧生產中的應用[J].飼料博覽，2006（2）：9-11.

[2] 孫建義.益生素研究的應用進展[J].生物工程進展，1995，15（1）：28-31

[3] 周德慶，郭杰炎. 我國微生態制劑的現狀和發展設想[J].工業微生物，1999，29（3）：19-29.

[4] KIM S J，CHO S Y，KIM S H，et al.Effect of microencapsulation on viability and other characteristics in Lactobacillus acidophilus ATCC 43121，LWT-Food Science and Technology，2008， 41（3）：493-500.

[5] 沈 萍，陳向東.微生物學實驗[M].北京：高等教育出版社，2007.

[6] 易中華.水蘇糖對肉雞生長性能、腸道生理及免疫功能的影響[D].北京：中國農業大學，2006.

[7] 閻風蘭，盧 崢，朱玉琴.肉仔雞飼喂桔草芽孢桿菌的效果研究[J].動物營養學報，1996，8（4）.34-38.

[8] 張 璐.飼用芽孢桿菌產品益生特性的體外評價研究[D].北京：中國農業科學院，2008.

[9] 薛勝平，杜連祥，路福平.酪酸菌、腸膜芽抱桿菌、糞腸球菌三聯菌益生特性研究[A].2005年中國工業微生物學術研討會[C].天津：天津科技大學出版社，2005.

[10] 王鋰韞，賀銀鳳，李少英，等.酸馬奶酒中糞腸球菌抑菌特性的研究[J].食品科技.2006（12）：15-17.

[11] JETT B D，HUYCKE M M，GILMORE M S，Virulence of Enterococci[J].Clinical Microbiology Reviews，1994，7（4）：462-478.

[12] Franz C M A P，Holzapfel W H，Stiles M E.Enterococci at the crossroads of food safety[J].International Journal of Food Microbiology，1999，47（1-2）：1-24.

[13] NILSEN T，NES I F，HOLO H.Enterolysin A，a cell wall-degrading bacteriocin from Enterococcus faecalis LMG 2333. Applied and Environmental Microbiology[J].Microbiology，2003， 69（5）：2975-2984.

[14] YAMAMOTO Y，TOGAWA Y，SHIMOSAKA M，et al. Purification and characterization characterization of a novel bacteriocin produced by Enterococcus faecalis strain RJ-II[J].Applied and Environmental Microbiology，2003，69（10）：5546-5553.

[15] ALEXANDRA K，XIAO-HUA CHEN，ANKE H，et al. Structural and functional characterization of gene clusters directing nonribosomal synthesis of bioactive cyclic lipopeptides in bacillus amyloliquefaciens strain FZB42[J].Journal of Bacteriology，2004，186（4）：1084-1096.