棉花育種中黃萎病抗性連鎖SSR標記輔助選擇的效果

摘要：利用長江流域棉花（Gossypium spp.）育種重要親本蘇棉12和荊55173（感黃萎病）與抗黃萎病資源Sicala V1和中21373配制兩套感病×抗病雜交組合（蘇棉12×Sicala V1和荊55173×中21373），在其雜交組合的自交子代群體中挑選與黃萎病抗性相關的9個SSR（Simple sequence repeat）標記實施分子標記輔助選擇（Marker-assisted selection，MAS）育種。結果表明，通過單標記選擇，8個SSR標記的aa與AA兩種基因型個體間的黃萎病校正病情指數（Correction disease index，CDI）差異達到極顯著或者顯著水平。利用多元逐步回歸分析得到的單標記、雙標記以及多標記3種篩選方法的效果，結果表明合理采取多個有效標記同時篩選能夠提高選擇的準確度。

關鍵詞：棉花（Gossypium spp.）；黃萎??；標記輔助選擇育種；簡單重復序列

中圖分類號：S562 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）23-6045-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.008

Abstract： The self-pollinated progenies derived from two cotton （Gossypium spp.） crosses（Jing55173×Zhong21373 and Sumian12×Sicala V1） of the susceptible cultivars（Sumian12 and Jing55173） and the highly tolerant cultivars（Sicala V1 and Zhong21373） to Verticillium wilt were used for resistance breeding with marker-assisted selection（MAS）. MAS of these progeny populations was put forward by nine simple sequence repeats（SSR） which related to quantitative trait locis（QTL） for Verticillium wilt resistance. For eight of nine SSRs，the difference of correction disease index（CDI） between aa and AA genotype individuals reached either significant or highly significant levels. The effects among single marker， two markers and multi-markers on MAS of cotton were compared using three makers that were selected by multiple stepwise regression analysis， the results showed that selective effects were enhanced through multi-markers way.

Key words： cotton（Gossypium spp.）； Verticillium wilt； marker-assisted selection breeding； simple sequence repeats

黃萎病是棉花（Gossypium spp.）高產和穩產的主要障礙，棉花黃萎病防治問題仍舊是世界性難題[1]?？剐云贩N的選育是最有效途徑。然而，抗病性既受環境條件的影響，又受制于寄主與病原菌之間的互作。育種進程勢必會因為誤判病情而受到耽誤[2]。

分子標記輔助選擇（Molecular marker assisted selection，MAS）可以將傳統表型選擇轉變為直接選擇基因型[3]。MAS抗病育種在水稻上已有不少成功先例[4]，在小麥[5]、玉米[6]等作物上也有少量成功報道。MAS育種也在棉花上陸續開展，集中在纖維品質、抗蟲、抗病方面。郭旺珍等[7]使用MAS聚合了高強纖維QTL（來源于品系7235）和抗蟲基因，培育出新品系南農85188。石玉真等[8]利用與高強纖維QTL緊密連鎖的2個SSR標記在不同群體中進行MAS，快速改良了sGK321和sGK9708的纖維強度。祁偉彥等[9]對以中植372為親本的各世代材料，利用黃萎病抗性連鎖SSR標記跟蹤檢測，篩選得到抗性強的后代，進而培養出抗病優質新品種。

湖北省的黃萎病育種受到氣候限制，相對黃河流域棉區和新疆棉區品種而言，湖北省棉花品種對黃萎病的抗性水平偏低，影響了湖北省高產品種在北方棉區的推廣使用。本研究試圖在抗病育種程序中，利用連鎖SSR標記對部分已經定位的黃萎病抗性QTL進行MAS，驗證SSR的MAS效果，篩選獲得可以應用于棉花黃萎病抗性MAS中的SSR標記及其組合，并初步探討影響黃萎病抗性MAS育種效率的因素，為黃萎病抗性的MAS育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

蘇棉12和荊55173是長江流域棉花育種的重要親本，豐產性和廣適性較好，屬于感黃萎病類型；Sicala V1和中21373是從國外和黃河流域引進的抗黃萎病資源。本研究選用上述材料作為親本，配制兩套感病×抗病雜交組合，分別為組合BP1（蘇棉12×Sicala V1）和組合BP2（荊55173×中21373）（圖1）。BP1F1和BP2F1連續自交，各自獲得不同世代，包括F2、F3、F4、F5。

1.2 黃萎病抗性鑒定

黃萎病抗性鑒定試驗采用2種不同方式，并設置3次重復。溫室里利用傷根接菌的方法鑒定黃萎病抗性。當棉苗長至二葉一心時，使棉苗外圍根系受到損傷（傷根程度盡量一致）后定量注射濃度2.48×107個/mL、具有中致病力的黃萎病菌液（病原菌從湖北省天門市發病棉區采集后分離出單菌落）18 mL。然后置于溫度為27 ℃，光/暗條件為16 h/8 h的溫室里繼續培養，定期澆水保持一定濕度。接菌后第30天，棉苗黃萎病病情逐漸穩定，第33天進行病情調查。大田里采用人工接種黃萎病菌的方式。移栽時先將營養缽置于濃度為1.03×107個/mL黃萎病液中浸泡，再移栽至大田。

1.3 抗病性調查

棉花黃萎病發病級別按0～4級劃分成5級[10]。感病對照為冀棉11。校正病情指數（Correction disease index，CDI）=個體實際病情指數×50.00/感病對照實際病情指數。其中，實際病情指數=Σ（各級病株數×該病級值）/（調查總株數×4）×100。病級（Disease grade，DG）=Σ（各級病株數×該病級值）/調查總株數。

1.4 SSR標記和基因型檢測

DNA抽提采用改良的CTAB法[11]。SSR標記的擴增、電泳和染色程序參照孔祥瑞等[12]和張軍等[13]的方法。為了便于統計分析，對于共顯性標記，電泳條帶與中21373相同時，個體基因型記作AA，否則記作Aa或aa；對于顯性標記，電泳條帶與中21373相同時，個體基因型記作Aa，否則記作aa。從已報道的36個黃萎病抗性相關SSR標記[14-19]中，選擇在2個群體的4個親本中具有多態性的9個SSR標記進行MAS。其中標記BNL1053檢測到2個多態性位點，分別記作BNL1053-1和BNL1053-2（表1）。

1.5 黃萎病抗病性狀的SSR標記輔助選擇

子代群體BPF2（共680個）依照大田產量（主要考察結鈴性）初步選擇之后得到BPF3（含75個株行）。然后在海南繁殖加代得到BPF4。本輪標記輔助選擇過程通過比較個體不同位點基因型與抗病親本基因型差異，淘汰差異十分明顯的個體。BPF5利用SSR標記著重選育抗或者較抗黃萎病的材料（圖1）。

1.6 統計分析

使用DPS軟件進行相關分析和多元逐步回歸分析，利用Excel 2003進行t檢驗。溫室能為棉苗發病創造良好的發病條件[20]，其鑒定結果比大田更穩定，因此回歸分析對象定為個體校正病情指數（YCDI），因子為SSR標記（見1.4）基因型值（Xmarker）。其中，AA、Aa和aa 3種基因型分別賦值為“2”、 “1” 和“0”。根據擬合模型中所保留的因子數命名為擬合模型1～8。

2 結果與分析

2.1 黃萎病抗性鑒定結果

該育種群體抗病性狀變異程度較大，病情離散分布。田間抗病性狀變異程度略低于室內（表2）。另外，方差分析結果也表明BPF4個體之間的抗病性差異極顯著（表3）。

2.2 連鎖SSR標記與黃萎病抗性的多元逐步回歸分析

用于MAS的9個SSR標記位點的基因型值（Xmarker）對校正病情指數（YCDI）產生極顯著的負向影響（表4）。經逐步回歸分析法扣除其中1～8個標記位點的影響，建立Xmarker與YCDI的擬合模型。當扣除6個標記位點時，YCDI與擬合模型中的各個因子的偏相關系數（r）全部達到顯著水平，而且其調整相關系數（Ra）為0.71，也十分接近最高值0.72，直觀地反映了XNAU1167、XNAU5467、XNAU3053對黃萎病YCDI產生更重要的影響。因此確定YCDI=47.036 481 7-8.245 074 816 XNAU1167-4.120 554 754 XNAU5467-4.587 778 119XNAU3053為較優擬合模型。

2.3 單標記對黃萎病抗性選擇的效果

利用NAU1167、NAU3053、NAU1225、NAU5428、NAU2859、NAU5120共6個標記中任一標記篩選后，基因型aa與AA類型間CDI差異均達到極顯著水平（表5）。利用NAU5467和BNL1053-1兩個標記中任一標記篩選后，基因型aa與AA類型間差異僅達到顯著水平。標記NAU1167、NAU5467、NAU3053在DNA電泳檢測時表現為共顯性，根據不同個體的標記基因型能將BPF4及其親本分為3類，分別屬于aa（a1a1、a2a2、a3a3）、Aa（A1a1、A2a2、A3a3）和AA（A1A1、A2A2、A3A3）基因型。標記NAU5467在基因型aa與Aa類型間進行t測驗時不顯著，但是在aa與AA類型間達到顯著水平，同時在AA與Aa類型間達到極顯著水平。標記NAU1167和NAU3053在不同類型之間進行t測驗時都達到極顯著水平。

2.4 雙標記、多標記對黃萎病抗性選擇的效果

BPF4及其親本經NAU1167/NAU5467、NAU1167

/NAU3053、NAU5467/NAU3053雙標記篩選后，aaaa與AAAA類型間個體黃萎病CDI的差異都達到極顯著水平（表5）。經三標記同時篩選后，aaaaaa與AAAAAA類型間個體黃萎病CDI的差異達到極顯著水平，而且其均值差為25.54，大于單標記和雙標記選擇結果。經單標記篩選后，aa與AA類型間CDI的均值差明顯低于雙標記選擇；經雙標記篩選后，aa與AA類型間CDI的均值差低于多標記選擇。由此可見，當不同標記用于黃萎病抗性輔助選擇時，同時運用多個有效標記進行選擇能夠提高選擇的準確度。

2.5 標記組合對大田黃萎病抗性選擇的效果

綜合以上分析結果篩選到最優標記組合為NAU1167/NAU5467/NAU3053。利用該標記在大田進行黃萎病抗性選擇后，得基因型a1a1a2a2a3a3的DG值為3.60，A1A1A2A2A3A3的DG值為2.13，兩者之間的均值差為1.47，抗感兩基因型間差異達極顯著水平?？剐暂^好的個體總體表現與感病對照相比，病級相差0.77。說明該標記組合的輔助選擇效果在大田依然能夠保持。盡管如此，由于其個體數都較少，因此還需作后續驗證。

3 討論

3.1 棉花黃萎病抗性輔助選擇中有效分子標記的篩選

由于不同研究間存在材料遺傳背景、發病環境條件、圖譜標記密度等差異，定位結果間一致性較差。除此之外，僅僅通過作圖群體估算的QTL效應仍有待驗證。本次研究涉及黃萎病相關SSR標記僅有部分在MAS育種上得到驗證。標記NAU5428、NAU1167、NAU5467、NAU2859均未見其應用于棉花黃萎病抗性MAS的報道。NAU5120和BNL1053已經被試圖應用于MAS中，并未達到預期效果[21]。標記NAU3053和NAU1225已經被應用于分子標記輔助聚合陸地棉抗黃萎病QTL中，獲得的材料聚合了多個QTLs，其抗病性與對照5026相比顯著增強[16]。

QTL定位結果能否應用于實際育種中，首先需要解決其連鎖標記是否有效的問題。構建群體BP的最終目標是獲得產量高、黃萎病抗性與抗源親本相當的資源材料。因此，在此類群體中實施黃萎病連鎖SSR標記輔助選擇，比較標記選擇和接菌鑒定結果，評價各個標記輔助選擇的效果。效果佳的SSR標記被他人直接利用后，MAS仍然見效。

3.2 影響黃萎病抗性輔助選擇育種效率的因素

QTL效應大小及其與側翼標記的遺傳距離是影響MAS順利、準確進行的主要因素。黃萎病抗性相關QTL分為主效和微效兩種類型。李志坤等[22]利用來源于Pima90-53中的SSR標記進行輔助選擇，160個BC1F1代單株材料中，平均檢出率達到84.0%，還發現少許單株雖然有抗病標記但是表現感病。推斷是由于標記BNL3255與目標QTL連鎖不夠緊密所致（其遺傳距離為13.7 cM）?？紫槿鸬萚12]采用分子標記輔助選擇技術將與陸地棉黃萎病抗性相關的18個SSR標記用于大田輔助選擇育種，其中的3個連鎖SSR標記BNL2865、BNL1721、BNL3452的貢獻率分別達到3.06%、13.89%、8.28%，并依據標記基因型分組的CDI結果推測BNL2865在MAS上無效。本研究中，BPF4及其親本經標記BNL1053-1篩選后，抗感兩種類型的CDI僅達到顯著水平；而經BNL1053-2篩選后達不到顯著水平。推測前者確實與黃萎病QTL連鎖，只是連鎖距離偏大，超過5 cM；后者與黃萎病性狀可能無關聯。此結果與前人研究結果基本一致，再次表明該標記不適用于棉花黃萎病抗性MAS[21]。標記NAU3053和NAU1167可解釋黃萎病抗性變異的百分率較高，并且比NAU5467高。經標記NAU3053和NAU1167篩選后，抗感兩種類型的CDI均能達到極顯著水平，經標記NAU5467篩選后，抗感兩種類型的CDI只能達到顯著水平。從一定程度上表明了挑選與效應較大QTL相關標記是提高黃萎病抗性MAS育種效率的重要途徑。

棉花抗黃萎病相關QTL或其緊密連鎖標記間的相斥和相引連鎖關系也是影響MAS效率的因素之一。NAU1225是通過江蘇棉區培育的品系60182檢測出的黃萎病抗性連鎖標記，其連鎖距離小[14]，而在育種群體BPF4中進行輔助選擇的相對效果不太明顯，可能是連鎖相改變引起的。只有在徹底了解其遺傳機制的基礎上，才能使MAS目標更明確。

未知QTL也是影響MAS效率的因素之一。多元逐步回歸分析得到Ra范圍為0.65～0.72，由此反映抗病性受其他未知QTL（解釋的變異至少占28%）的影響。

育種實踐中為選擇到理想、優良的資源材料，大多需擴大群體數量。欲開展大規模MAS成本很高，但合理減少標記可以使其成本大幅下降。依據育種目標對連鎖標記進行細致篩選，以運用最少的標記達到較為理想的選擇效果[23]。為簡化標記檢測過程，在此應忽略回歸分析中相關系數低的標記的選擇作用，例如，標記NAU1225、NAU5428、NAU2859雖然能解釋相對較大的黃萎病抗性變異或者與抗病性存在較強的關聯，但因其R低于其余6個標記，也會被剔除。標記NAU5120和NAU3053同在D7染色體上，距離17.0 cM，二者可能與相同的QTL連鎖。為避免MAS中標記的選擇作用重疊，優先選用其中篩選效果更佳的標記NAU3053。綜上所述，最終挑選出3個SSR標記（NAU3053、NAU1167和NAU5467）建立Xmarker與YCDI的擬合模型。

QTL/基因定位方法的不斷革新以及棉花基因組圖譜的日趨完善將使MAS現存的諸多問題不斷得到解決。近年來全基因組關聯分析（Genome-wide association study，GWAS）成為遺傳育種領域的熱點。GWAS直接利用基因本身或基因附近微小區域的分子標記與性狀表型的關聯來實現基因的精細定位[24]?；赟NP標記的GWAS所定位的QTL解釋表型變異率高，可增強MAS的目的性和準確性。陸地棉基因組測序的完成，極大地推動了棉花的遺傳改良和基礎生物學研究[25]?？焖?、高通量分型技術——SNP芯片的應用，有助于基因精細定位以及克隆，發掘SNP位點?？梢灶A見，尋找與黃萎病相關QTL/基因緊密連鎖的SNP標記，設計配套的MAS最佳方案，勢必成為真正實現棉花黃萎病MAS育種快速高效的突破口。

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