大腸桿菌工程菌利用甘蔗糖蜜發酵產L—乳酸研究

摘要：大腸桿菌HBUT-L來源于HBUT-D，因此具有快速利用蔗糖的特性。對HBUT-L利用蔗糖及甘蔗糖蜜發酵產L-乳酸的特性進行了研究。結果表明，該菌株在96 h的發酵過程中，可將100 g/L的蔗糖轉化生成60.0 g/L乳酸，轉化率達到74.0%，雜酸產量少，具有工業化開發潛力。在玉米漿培養基中可以直接添加未經處理的甘蔗糖蜜，發酵周期持續224 h，發酵液所得乳酸產量為87.0 g/L，發酵液殘糖為28.6 g/L，但乳酸產率極低，僅為0.389 g/（L·h），后續將對甘蔗糖蜜預處理工藝進行研究，進一步提高乳酸發酵速度和產量。

關鍵詞：大腸桿菌工程菌；甘蔗糖蜜；發酵；L-乳酸

中圖分類號：TQ92 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）24-6541-04

L-乳酸是一種重要的有機酸，廣泛應用于食品、醫藥和化工領域，L-乳酸最具前景的應用在于聚乳酸（PLA），PLA是一種可降解的、具有良好使用性能的生物相容性高分子材料，用于制造可生物降解塑料，近些年一直成為關注和研究的熱點[1]。但是，由于乳酸生產成本偏高，使得聚乳酸制造成本居高不下，難以在價格上與傳統塑料競爭。因此，如何高效低成本地生產L-乳酸顯得尤為重要[2]。

微生物發酵法生產乳酸因其原料來源廣泛、產品光學純度高、安全性高等優點已成為生產乳酸的主要方法。目前發酵工業上生產乳酸的原料主要是淀粉質原料，常用的有大米、小麥、玉米、馬鈴薯、紅薯、木薯等，這也是造成乳酸生產成本較高的原因之一。由于乳酸及其衍生物應用研究的不斷深入，利用農業廢棄物、制漿造紙污泥、紡織廢料和食品工業含糖廢料和下腳料等作為廉價碳源進行乳酸發酵，已經成為該領域的研究熱點，一方面可以解決廢棄物的資源化問題，同時還能夠降低乳酸的生產成本[3，4]。

甘蔗糖蜜是糖廠生產過程中的主要副產品，其干固物中含有約40%的蔗糖和15%的還原糖，可作為微生物發酵的碳源，甘蔗糖蜜可用于發酵生產多種產品，如乙醇、味精、檸檬酸、賴氨酸、焦糖色素等。目前國內尚未有利用甘蔗糖蜜發酵制L-乳酸的工業化生產，甘蔗糖蜜用于乳酸發酵相關報道還僅限于實驗室研究階段。黃靖華等[5]經過誘變篩選得到一株鼠李糖乳桿菌SCT-10-10-60，可利用甘蔗糖蜜為原料發酵生產L-乳酸，發酵40 h后，L-乳酸的產量最高可以達到106 g/L。汪群慧等[6]分離純化并獲得一株乳酸桿菌FM37，采用正交設計試驗對其進行糖蜜發酵產L-乳酸的研究，并得出初始糖濃度對乳酸產量的影響最顯著。廣西大學秦菊蔽等[7]通過誘變篩選獲得一株米根霉，并對其以蔗糖及甘蔗糖蜜為碳源生產L-乳酸的發酵條件進行了研究。

近年來，國內外開始研究使用大腸桿菌（Escherichia coli）基因工程菌發酵生產L-乳酸。大腸桿菌具有遺傳背景清楚、易操作、易調控、培養基要求簡單和生長迅速等優點，易于進行工業化大規模生產。野生大腸桿菌在糖酵解過程中產生一系列有機酸（甲酸、乙酸、琥珀酸、乳酸）和乙醇等[8]，乳酸占總代謝產物不到50%。因此，需要通過代謝工程手段阻斷乳酸的競爭性支路，將代謝流引向乳酸的產生，構建高產量、高光學純度大腸桿菌基因工程菌。本實驗室在D-乳酸工程菌HBUT-D（來源于原始菌株E. coli W（ATCC 9637））[9]的基礎上，利用染色體插入技術，引入乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的ldhL基因[10]，構建可生產L-型乳酸的大腸桿菌工程菌株HBUT-L（ΔfrdBC，ΔadhE，Δpta，ΔpflB，ΔcscR，ΔaldA，ΔldhA∶∶ldhL）。該菌株能在無機鹽培養基中高效利用葡萄糖進行L-型乳酸發酵，并能利用蔗糖發酵產L-乳酸，發酵60 h后，L-乳酸產量達到81.92 g/L，光學純度可達到99.9%，糖酸轉化率為82%[11，12]，具有極大的工業化應用價值。

本研究主要利用甘蔗糖蜜為碳源，研究大腸桿菌工程菌生產L-乳酸的發酵特性，以此為低成本L-乳酸工業化生產提供技術參考，同時也為開發糖廠廢蜜高附加值產品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 Escherichia coli HBUT-L（ΔfrdBC，ΔadhE，Δpta，ΔpflB，ΔcscR，ΔaldA，ΔldhA∶∶ldhL）由本試驗構建和保藏，該菌株是以可利用蔗糖發酵產D-乳酸的工程菌HBUT-D為出發菌株，利用同源重組技術敲除其D-乳酸脫氫酶基因，同時插入乳酸片球菌的L-乳酸脫氫酶基因（1dhL），并帶有自身啟動子序列，該工程菌具有良好的L-乳酸發酵特性。

1.1.2 原料和培養基 甘蔗糖蜜購自廣西柳州蔗糖廠，總糖含量為48%，其中蔗糖為主，占51.7%，其次為果糖，含量為30.6%，葡萄糖最低，為17.7%，保存于4 ℃冰箱備用，使用時按重量比1∶3加去離子水稀釋后，經0.45 μm濾膜過濾，在121 ℃條件下滅菌15 min。玉米漿由山東濰坊盛泰藥業有限公司提供，使用時無需預處理，115 ℃滅菌30 min后直接使用。

種子培養基：NBS培養基[13]，添加2%蔗糖。

無機鹽發酵培養基：NBS培養基，添加10%蔗糖，再加入1 mmol/L甜菜堿。

玉米漿發酵培養基：玉米漿直接添加甘蔗糖蜜，使培養基中蛋白質含量在20 g/L左右，總糖含量達到10%。添加2 mmol/L甜菜堿。

1.1.3 主要儀器設備 BIOSTAT？誖Bplus發酵罐（德國賽多利斯公司），722型可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司），Agilent 1200 series反相高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司），恒溫搖床（上海智誠分析儀器制造有限公司），恒溫振蕩培養箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 種子培養 將HBUT-L接種于NBS蔗糖固體平板，于37 ℃培養箱中培養24～48 h，接入種子培養基中（1 000 mL三角瓶，裝液量500 mL），200 r/min，37 ℃條件下搖瓶培養至菌體濃度（OD600）達到1.2～1.5。

1.2.2 發酵方式 NBS培養基發酵：按5%的接種量接入帶有自動調節系統的7 L發酵罐中，裝有體積為4 L NBS培養基。發酵罐條件為初始糖含量10%，轉速200 r/min，37 ℃，以6 mol/L KOH作為中和劑，采用流加方式控制pH穩定在7.0左右。定時取樣，檢測OD值、糖濃度、L-乳酸產量及其他雜酸濃度。

玉米漿培養基發酵：接種量為10%，其他操作同上。

1.2.3 發酵產物分析 OD值采用紫外分光光度計測量，波長選定600 nm；所取發酵液樣品在10 000 r/min條件下離心10 min，去除細胞殘留，收集上清液用于測定殘糖及其他代謝產物的含量。殘糖含量和有機酸檢測采用高效液相色譜法（HPLC）檢測。Agilent 1200 series反相高效液相色譜儀檢測條件為[14]色譜柱：Bio-Rad HPX 87H；流動相：4 mmol/L H2SO4；檢測器：示差檢測器；柱溫：35 ℃；進樣量： 20 μL；流速：0.5 mL/min。乳酸光學純度采用HPLC測定檢測條件為：色譜柱：NUCLEOSIL 120-5 Chiral-L；流動相：0.2 mmol/L H2SO4；紫外檢測器240 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；流速：0.5 mL/min。

1.2.4 計算方法 乳酸和蔗糖濃度以發酵初始體積（4 L）計算，其濃度由測量值乘以發酵體積（初始體積與加堿體積之和，取樣體積忽略不計）再除以發酵初始體積計算得到。

2 結果與分析

2.1 HBUT-L在NBS培養基的發酵特性

大腸桿菌工程菌HBUT-L厭氧條件下，在含有10%蔗糖的4 L無機鹽培養基中發酵，發酵過程中定期取樣，檢測細胞生物量、殘糖和乳酸產量，結果如圖1所示。工程菌HBUT-L來源于HBUT-D，因此具有快速利用蔗糖的特性，發酵到48 h時OD600達到4.16，之后進入穩定期。96 h發酵結束。經檢測，發酵液中乳酸產量為60.0 g/L，轉化率達到74.0%，乳酸產率最大值達到0.98 g/（L·h）。

發酵液中主要代謝產物為乳酸，僅有少量乙酸和甲酸產生，其產量分別為0.39、0.06 g/L，發酵液中未檢測到琥珀酸及乙醇產生，結果如圖2所示。發酵液中雜酸產量少，乳酸濃度占總酸產量的99.3%，有利于后續的分離純化。

對HBUT-L發酵產生的L-乳酸進行光學純度分析（圖3），經檢測光學純度達到99.3%以上。該結果說明通過乳酸脫氫酶基因的替換（ldhL→ldhA），可發酵產生高光學純度L-乳酸。

2.2 HBUT-L在玉米漿培養基中的發酵特性

大腸桿菌工程菌HBUT-L可利用玉米漿和蔗糖糖蜜發酵生產L-乳酸，其發酵結果如圖4所示，整個發酵周期持續至224 h，經檢測，發酵液中乳酸產量為87.0 g/L。本研究中所用甘蔗糖蜜中蔗糖占主要成分，還含有果糖和葡萄糖，其液相色譜圖見圖5。發酵結束后，總殘糖為28.6 g/L，其中果糖濃度最高，為23.2 g/L，其次為蔗糖和葡萄糖，由此可見，HBUT-L可有效利用蔗糖和葡萄糖，同時也能部分利用果糖。HBUT-L來源于HBUT-D菌株，為了促進蔗糖代謝操縱子基因cscA、cscB、cscK的表達，其蔗糖啟動子抑制基因cscR已經被敲除掉，因此，蔗糖可以被有效的轉運并進一步水解生成果糖，但是果糖地累積說明HBUT-L對果糖的代謝和利用是不完全的，推測原因可能是由于果糖激酶活力不高。Sabri等[15]也報道指出，蔗糖的充分利用需要3種酶的協同作用，蔗糖透過酶CscB、蔗糖水解酶CscA和果糖激酶CscK，因此，后續可以對HBUT-L進一步進行分子改良和遺傳馴化，提高其蔗糖和果糖的利用效率。

本研究所得甘蔗糖蜜乳酸發酵產率很低，僅有0.389 g/（L·h），推測甘蔗糖蜜中的某些物質可能阻礙了微生物生長和發酵，使發酵周期延長。有文獻也報道指出，甘蔗糖蜜含有膠體物質、灰分和其他懸浮物質，這些雜質可能會妨礙微生物的生長和發酵。因此，糖蜜在使用前，一般要根據發酵菌株的要求進行合適的前處理，發酵過程中可能還需添加一些其他營養成分[16]。本試驗所用糖蜜只經過稀釋和高壓滅菌，沒有進行過預處理。可進一步研究甘蔗糖蜜的預處理，以除去其中的抑制發酵的物質，縮短發酵周期。

3 小結與討論

研究利用來源豐富、廉價的發酵底物甘蔗糖蜜也成為人們關注的熱點。中國是世界上第三大產糖國，甘蔗制糖是制糖行業的主體，但是在甘蔗制糖過程中會產生大量的廢糖蜜和蔗渣，目前大部分制糖企業利用廢糖蜜生產乙醇，但所得的乙醇廢液中COD高達104～105 mg/L以上。因此，如何合理有效地將制糖工業加工副產物進行資源化利用，已經成為一項重要的研究課題，一方面能變廢為寶，創造經濟價值，同時又能解決環境污染問題。

本研究中所采用的工程菌HBUT-L，同其出發工程菌HBUT-D一樣，也來源于野生型菌株E. coli W（ATCC 9637，Scr+），該野生菌作為為數不多的Scr+型菌，具有可直接利用蔗糖的能力[17]。同時，該工程菌保留了ppc基因（磷酸烯醇丙酮酸羧化酶），仍具有合成氨基酸的能力，因此發酵過程中可直接利用無機鹽培養基，降低了對營養成分的需求，可進一步減少生產成本。蔗糖發酵結果顯示HBUT-L的乳酸產量為60.0 g/L，光學純度可達到99%以上，雜酸產量少，具有很大的工業化應用潛力。

玉米漿含有可溶性蛋白質、生物素、無機鹽等，營養豐富，常常被用作細菌發酵的有機氮源，以取代昂貴的酵母粉、牛肉膏。但是，利用玉米漿發酵產L-乳酸仍存在產量低的問題，很難達到工業化的要求，并且常常需要向玉米漿中添加其他物質或需對其進行特殊處理。本研究在前期已經通過試驗證實，HBUT-L在玉米漿發酵培養基中能生長，并且可高效快速地將葡萄糖轉化成L-乳酸，經過50 h厭氧發酵，乳酸產量可達到108.3 g/L，糖酸轉化率在97%以上，產率為2.16 g/（L·h）[18]。

目前，國內一般不宜直接利用甘蔗糖蜜發酵生產L-乳酸，本研究所采用的工程菌HBUT-L在玉米漿發酵培養基中可以發酵甘蔗糖蜜產L-乳酸，甘蔗糖蜜在沒有經過預處理條件下，發酵周期需要224 h，乳酸產量為87.0 g/L，發酵液殘糖為28.6 g/L，乳酸產率僅為0.389 g/（L·h），后續將進一步對甘蔗糖蜜預處理工藝進行研究，提高乳酸發酵速度和產量，為制糖工業加工副產物的資源化利用和L-乳酸工業化生產提供技術參考。

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