高黃酮含量野葛淀粉提取工藝優化

摘要：采用單因子和正交試驗方法對富含黃酮的野葛（Pueraria lobata）淀粉提取工藝進行了研究，對水、甲醇、乙醇3種溶劑提取效果進行了比較，以淀粉中的總黃酮含量為參考指標，分別對4個提取參數（提取溫度、乙醇體積分數、提取時間、固液比）進行單因子試驗，然后采用正交試驗對提取條件進行優化。結果表明，野葛淀粉高黃酮含量提取的工藝條件為提取溫度35 ℃、乙醇體積分數50%、提取時間3.0 h、固液比1∶8（kg∶L）。

關鍵詞：野葛（Pueraria lobata）；黃酮；淀粉

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）24-6537-04

EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯）作為茶葉中的一種有效成分，具有抗病毒、抗氧化、抑菌消炎等功能[1]，在體內外試驗中被證實具有廣泛的抗癌活性，其抗癌機理包含誘導細胞凋亡、調控細胞周期、阻滯細胞轉移、協同抗癌等[2]。近年來對其功效的研究日趨深入和完善，被廣泛用于食品、保健品和日化領域。本研究通過對高純度EGCG的提取、分離純化工藝的探討，為放大生產EGCG提供參考，對提高湖北省秋茶的利用率具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶葉原料 茶葉原料來自湖北省農業科學院果樹茶葉研究所茶葉資源圃種植的鄂茶1號、鄂茶5號、鄂茶8號、中茶108和福鼎大白。

1.1.2 試驗試劑 乙醇為分析純（國藥集團化學試劑有限公司），冰醋酸、乙腈為色譜純（美國Fisher Chemical）。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料篩選 在前人研究基礎上[3]，選擇EGCG含量相對較高的茶葉資源作為試驗原料。采摘一芽二葉（采摘日期為2015年8月6日），100 ℃純水蒸制3 min，100 ℃烘至足干，茶樣粉碎后過40目篩，分別稱取3 g，加入500 mL水，100 ℃浸提45 min，得到的濾液定容至500 mL，HPLC法檢測其EGCG含量。

1.2.2 EGCG的提取 單因素試驗：按照茶多酚提取方法，浸提溫度選取40、50、60、70、80、90、100 ℃，浸提時間選取30、40、50、60、70、80、90 min，浸提料液比選取1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20（g/mL，下同），以此研究各因素的影響作用。

正交試驗：通過單因素試驗，分析各因素對EGCG浸出量的影響，確定較佳的單因素試驗條件范圍，在此基礎上，以浸提溫度、浸提時間、料液比為主要影響因素，各選出4個水平，安排L16（43）正交試驗分析。

1.2.3 EGCG的分離純化 樹脂的預處理：樹脂在使用之前需要進行有效的預處理，以除去制備和貯存中引入的雜質。一般預處理的方法是：①乙醇浸泡。樹脂浸泡在95%左右濃度的乙醇中，乙醇的液面高于樹脂，不停攪拌以使樹脂和乙醇充分接觸，對樹脂進行初步的浮選。浸泡時間一般為24 h。②乙醇沖洗。浸泡后的樹脂濕法上柱，再用95%的乙醇沖洗，直至流出液清亮無渾濁為止。③3%的氫氧化鈉溶液的浸泡和沖洗。先將經乙醇浸泡沖洗過的樹脂浸泡于3%的氫氧化鈉溶液中4 h，再以2 BV 3%的氫氧化鈉溶液沖洗樹脂，最后用蒸餾水沖洗至中性。④5%的檸檬酸沖洗。先將經3%的氫氧化鈉溶液浸泡沖洗過的樹脂浸泡于5%的檸檬酸溶液中4 h，再以2 BV 5%的檸檬酸沖洗樹脂，最后用蒸餾水沖洗至中性[4]。

樹脂的篩選：在劉偉等[5]、王偉濤等[6]研究基礎上，選擇AB-8、HPD-826和聚酰胺三種樹脂。根據前期研究發現，樹脂在使用3～15次時柱效穩定、分離效果較佳，故選取使用過2次的3種樹脂各8 g，分別置于500 mL的具塞磨口燒瓶中，加入2%濃度的原茶湯400 mL，在恒溫搖床（30 ℃、140 r/min）上充分吸附2 h，考察樹脂對EGCG的吸附量。冰箱中靜置約12 h后過濾，濾液中加入200 mL 80%的乙醇，在恒溫搖床上充分解吸2 h，得解吸液。將以上的原茶湯、吸附后茶湯殘留液和解吸液各用移液管吸取5 mL，定容至50 mL，進行HPLC分析檢測，并按下式分別計算吸附量和解吸率：

式中，Q為吸附量（mg/g），M為去游離水的樹脂質量（g），E為解吸率，V1為茶湯原始體積，V2為80%乙醇洗脫液體積，C1為原茶湯溶液濃度（mg/mL），C2為樹脂吸附后剩余茶湯殘留液濃度（mg/mL），C3為80%乙醇洗脫液濃度（mg/mL）。

洗脫劑濃度的選擇：選用篩選到的樹脂，茶湯（500 mL，濃度為20 mg/mL）上柱流速控制在1 BV/h，上柱后靜態吸附2 h，開展解吸試驗。先研究水洗量對咖啡因和EGCG含量的影響，再分別制備乙醇濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的洗脫液，解吸流速控制在1 BV/h，研究EGCG和咖啡因在樹脂中的乙醇梯度洗脫的含量變化。

1.3 高效液相色譜分析檢測方法

色譜柱為PhenomenexGemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相A：0.2%乙酸水溶液（V/V），流動相B：乙腈。流速：0.8 mL/min；檢測波長：278 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。標準曲線：準確稱取EGCG標準樣品，溶于一定量的25%乙腈水溶液中，分別配制成不同濃度梯度的標準溶液，根據EGCG標樣及相對保留時間作為定性方法，以峰面積計算其含量，工作曲線Y=11 004 641.426X-528 274.199。其中Y為峰面積；X為樣品濃度（mg/mL）。洗脫梯度見表2。

2 結果與分析

2.1 原料篩選

表3為不同茶葉資源中EGCG的含量。由表3可見，鄂茶1號中EGCG含量相對較高，可用作提取分離純化高純度EGCG單體的原料。

2.2 EGCG的提取

2.2.1 單因素試驗結果 圖1表明，浸提液中EGCG的含量隨著浸提溫度的升高先升后降，分析其原因為浸提以擴散原理為基礎，隨溫度升高，擴散速度加快，浸提液中EGCG含量有所增加，但當溫度到達一定值后，EGCG的氧化速度也加快，含量反而有所下降。

圖2表明，浸提液中EGCG的含量隨著浸提時間的延長先升后降，分析其原因為固-液浸提過程為三步[7]：①溶劑進入固體內部，溶質溶解；②溶質從固體內部到表面；③溶質溶解液從固體表面到溶劑中。這個過程需要一定的時間，在這個時間范圍內，隨浸提時間的延長，EGCG浸出量增加，但當浸提時間到達一定值后，因溫度原因EGCG的氧化速度加快，含量反而有所下降。

圖3表明，在選取的料液比范圍內隨著浸提用水量的增加，浸提液中EGCG含量一直呈上升趨勢，但當料液比達到1∶16后，再增加浸提用水量，對EGCG的浸出影響不大，分析其原因為茶粉中所含的EGCG量是一定的，當浸提用水量到達一定值后，茶粉中EGCG已全部浸提出，再增加用水量EGCG也沒有明顯增加，反而會因溫度等原因加快EGCG的氧化，同時給后續吸附、解吸和濃縮處理增加能耗，提高生產成本。

2.2.2 正交試驗確定浸提茶多酚和EGCG的最佳條件 根據單因素試驗結果，浸提溫度選取60、70、80、90 ℃，浸提時間選取40、50、60、70 min，浸提料液比選取1∶14、1∶16、1∶18、1∶20，正交分析結果見表4和表5。

由表4可知，最佳浸提工藝組合為A2B3C4，即浸提溫度70 ℃，浸提時間60 min，料液比1∶20，此條件下茶湯中EGCG含量為9.041%。由表5可知，浸提溫度和料液比對浸提液中EGCG含量的影響顯著，浸提時間對浸提液中EGCG含量的影響不顯著。

2.3 EGCG的分離純化

2.3.1 樹脂的篩選結果 由表6可見，聚酰胺樹脂優于其他兩種，可用于較好地分離純化茶湯中的EGCG單體。分析其原因是聚酰胺樹脂具有的酰胺基與EGCG分子上的酚羥基進行氫鍵締合能產生較好的吸附作用，用高濃度乙醇洗脫時解吸率也較高。

2.3.2 洗脫梯度選擇 浸提液上柱完成后先用純水洗脫，這是因為咖啡因屬于嘌呤生物堿，在溶劑中作為氫鍵受體，不易與聚酰胺樹脂形成較強吸附作用，而EGCG的酚羥基與聚酰胺樹脂的酰胺基具有很好的氫鍵結合力，所以用純水沖洗時，水洗量對EGCG的含量幾乎無影響，對咖啡因的解吸效果影響比較明顯。由圖4可見，解吸液中咖啡因含量隨水洗量的增加呈現先升后降的趨勢，且在500 mL水洗量（1 BV料液）的時候咖啡因的含量達到最高。

由圖5可知，解吸液中EGCG含量隨著乙醇濃度的提高而升高，乙醇濃度為80%時達到最高，而后稍降低，分析其原因為乙醇分子中的羥基與EGCG分子中的酚羥基有很強的氫鍵結合力，有效取代了聚酰胺樹脂與EGCG分子的結合，但是聚酰胺樹脂結合的EGCG分子數量是一定的，所以當乙醇濃度到達一定值后，過剩的乙醇分子開始結合除EGCG以外的其他分子，導致解吸液中EGCG含量反而有所下降。

由圖6可見，咖啡因含量隨著乙醇濃度的提高而降低，當乙醇濃度達到70%以后，變化微小。分析其原因為低純度乙醇溶液中極性和非極性分子同時大量存在，可充分洗脫出樹脂柱中的咖啡因，隨乙醇濃度增加，極性分子含量增多，非極性分子含量減少，咖啡因的解吸量反而下降。

綜合圖4、圖5和圖6的結果，從產品的品質和成本考慮，選用梯度洗脫：先用1 BV的純水洗脫，再用1 BV 20%乙醇洗脫，最后用1 BV 80%乙醇洗脫，所得解吸液經懸轉蒸發濃縮后冷凍干燥，但試驗最終得到的EGCG單體純度僅為90.87%。為解決產品純度問題，考慮兩次上柱純化的方案，最終得到純度為95.21%的EGCG單體，但得率僅為0.276%。

3 小結與討論

3.1 結論

湖北省廣泛種植的5種茶葉資源中，鄂茶1號的EGCG含量相對較高，可用作提取、分離純化高純度EGCG單體的原料。

用純水浸提，浸提溫度70 ℃，料液比1∶20條件下浸提60 min，所得浸提液中EGCG含量最高。

聚酰胺樹脂由于其酰胺基能對含酚羥基的EGCG具有較好的吸附作用，且對CAF的選擇吸附作用較低，非常符合本試驗制備無酯兒茶素產品的要求。聚酰胺樹脂純化兒茶素最佳工藝條件為：上樣流速1 BV/h、茶湯濃度為20 mg/mL，解吸流速為1 BV/h，分別用1 BV的水、1 BV 20%的乙醇溶液以及1 BV80%的乙醇溶液進行梯度洗脫。

通過兩次柱層析分離純化，得到的EGCG單體純度可達95.21%。

3.2 討論

本研究通過提取、分離純化工藝的探討，得到了高純度EGCG單體，工藝綠色無污染，對提高湖北省秋茶的利用率具有重要意義，但是得率低，成本相對較高。預計從兩方面著手開展后續試驗：一是擴大高EGCG含量茶葉資源[8]的篩選范圍，從湖北省擴大到全國；二是進一步篩選合適的樹脂，力求一次柱層析可分離純化得到95%純度的EGCG單體，減少損耗，提高得率。

參考文獻：

[1] SINGH B N，SHANKAR S，SRIVASTAVA R K.Green-tea-catechin，epi-gallocatechin-3-gallate（EGCG）：Mechanisms，perspectivesand clinical applications[J].Biochem Pharmacol，2011，82：1807-1821.

[2] 劉 飛，熊政委，李春華.表沒食子兒茶素沒食子酸酯分子修飾及抗癌研究進展[J].食品科學，2015，36（23）：321-328.

[3] 金孝芳，賈尚智，石亞亞，等.湖北省地方審定茶樹品種中兒茶素含量分析[J].浙江農業學報，2014，26（1）：67-71.

[4] 顏棟美，李仁菊.膜分離和聚酰胺吸附對金花茶多酚的純化[J].食品與機械，2010，26（1）：42-43，91.

[5] 劉 偉，陳 茜，周 潔，等.柱色譜分離制備無酯兒茶素[J].食品工業科技，2012，33（18）：58-62.

[6] 王偉濤，馬朝陽，陳尚衛，等.吸附柱層析法制備純化茶多酚中 EGCG單體[J].天然產物研究與開發，2014（10）：1647-1653.

[7] 崔繼來，華 飛，龔正禮.速溶綠茶粉浸提工藝參數優化[J].食品科學，2011，32（12）：130-132.

[8] 唐曉波，劉曉軍，王小萍.高EGCG茶樹品種的篩選及開發[J].浙江農業科學，2010（1）：60-61.