三種鴨防御素真核表達載體的構建及其表達分析

摘要：為研究鴨防御素的真核表達，人工合成了鴨防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因，并將其插入到真核表達質粒pDoubleEx-EGFP-flag-N中構建重組表達質粒；重組表達質粒經酶切鑒定正確后，分別轉染HEK293細胞進行表達，用RT-PCR和Westem-blot鑒定目的基因的表達情況。結果表明，酶切鑒定證實目的基因成功插入到真核表達質粒中；真核表達質粒轉染HEK293細胞24 h后，在熒光顯微鏡下可見綠熒光蛋白表達；RT-PCR能檢測到目的基因mRNA，但Western-blot沒有檢測到目的蛋白的表達條帶。

關鍵詞：鴨防御素；真核表達；HEK293細胞

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）24-6597-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.068

由于抗生素易導致藥物殘留、病原耐藥性等問題，人們希望研發出安全有效的抗菌肽類藥物，替代部分抗生素的使用。禽類防御素（Avian beta defensin，AvBD）作為一類重要的內源性抗菌肽，具有廣譜的抗菌活性和免疫調節功能[1]，在禽類先天性免疫和獲得性免疫中均發揮著重要作用。因此，禽類防御素極具新藥開發價值，有望用于畜禽疾病的防控。

目前，人們已在家禽及某些野禽中發現了數十種禽類防御素，并且在大腸桿菌或酵母菌中成功表達了多種禽類防御素。然而，關于禽類防御素在動物細胞中表達的報道卻很少。理論上，動物細胞能為表達蛋白提供更好地表達后加工和修飾，是表達具有天然活性蛋白的最佳宿主[2]。如果能用動物細胞表達禽類防御素，將為禽類防御素的研究和應用提供幫助。本研究根據GenBank中已發布的鴨防御素基因序列，人工合成了3種鴨防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因，并構建其真核表達載體，在HEK293細胞中進行了表達研究，為鴨防御素在動物細胞中的表達提供了參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、菌株與質粒

HEK293細胞及真核表達質粒pDoubleEx-EGFP-flag-N由長沙贏潤生物技術有限公司提供；大腸桿菌DH5？琢感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；表達豬β防御素1（PBD1）的重組質粒pDoubleEx-EGFP-flag-N-PBD1由武漢市農業科學技術研究院畜牧獸醫科學研究所構建。

1.2 主要試劑

限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker和蛋白質Marker等分子生物學試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、RNA提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；質粒小提試劑盒購自OMEGA公司；flag標簽抗體購美國CMC公司；HRP標記羊抗小鼠IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；轉染試劑Lipofectamin 2000購自Invitrogen公司；PCR用試劑購自南京諾唯贊生物科技有限公司；牛血清和細胞培養基為Gibco公司產品；其他常規試劑為分析純。

1.3 方法

1.3.1 鴨防御素基因的人工合成 根據GenBank上公布的序列信息，人工合成鴨防御素AvBD2（登錄號AY641439.1）、AvBD10（登錄號XM_005028240.1）

和AvBD12（登錄號KR018387.1）基因片段，并在基因片段兩端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點。基因合成后連接大腸桿菌克隆載體pUC57-Simple，測序驗證合成的序列是否正確。

1.3.2 重組表達質粒的構建 根據設計的酶切位點將合成的基因片段進行雙酶切，用DNA凝膠回收試劑盒回收酶切后的基因片段。同法回收酶切后的真核表達質粒，按如下反應體系和條件進行連接反應：10×T4 DNA Ligase Buffer 1.0 μL，T4 DNA Ligase 1.0 μL，回收的pDoubleEx-EGFP-flag-N質粒0.7 μL，回收的AvBD基因片段7.3 μL，總反應體積10.0 μL，16 ℃恒溫水浴中連接過夜。

1.3.3 重組表達質粒的提取與酶切鑒定 取大腸桿菌DH5？琢感受態細胞100 μL，加入連接產物5 μL并混勻，置冰上10 min后，42 ℃水浴熱激90 s，隨即冰浴2 min；加入500 μL LB培養基，恒溫搖床振蕩培養30 min使其復蘇；復蘇后的菌液10 000 r/min離心2 min，棄去500 μL上清液，用剩余的100 μL重懸菌體，涂布于含有25 μg/mL卡那霉素的LB瓊脂平板上；37 ℃倒置培養12～16 h，直至長出單菌落；挑取平板上長出的單菌落，接種到含卡那霉素的LB培養基中，恒溫搖床振蕩培養約8 h。取培養后的菌液，用質粒小提試劑盒提取重組表達質粒，進行雙酶切鑒定。酶切鑒定的反應體系：10×K Buffer 2.0 μL，NheⅠ 1.0 μL，EcoRⅠ 1.0 μL，重組表達質粒12.0 μL，加ddH2O至20.0 μL。37 ℃酶切4 h后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。

1.3.4 細胞培養與重組表達質粒的轉染 將生長狀態良好的HEK293細胞用胰酶消化，稀釋到1×105個/mL，接種于24孔細胞培養板，每孔2 mL。置37 ℃恒溫培養箱（含5%的CO2）中培養18～24 h至80%細胞匯合。轉染前棄去培養液，用OPTI-MEM洗滌一次。按轉染試劑Lipofectamin 2000說明書中的步驟，將重組表達質粒、Lipofectamin 2000試劑分別用OPTI-MEM稀釋，然后混合，轉染HEK293細胞。轉染6 h后，更換含10%胎牛血清的DMEM培養基（不含雙抗），置37 ℃恒溫培養箱中繼續培養24 h。

1.3.5 轉染細胞中目的基因mRNA的檢測 離心收集轉染后的細胞，用RNA提取試劑盒抽提細胞總RNA。用DU640型核酸/蛋白測定儀測定核酸濃度，稀釋RNA濃度至100 μg/mL。用一步法RT-PCR試劑檢測目的基因mRNA，反應體系：2×One step Mix 12.5 μL，one step Enzyme Mix 1.25 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L） 1 μL，RNA模板1 μL，ddH2O補足至25 μL。反應條件：50 ℃反轉錄30 min；94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃延伸7 min。取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳并照像。PCR檢測所用引物及擴增片段見表1。

1.3.6 表達蛋白的鏡檢和Western-blot鑒定 轉染24 h后，將細胞培養板置于倒置熒光顯微鏡下，觀察細胞是否有綠色熒光。收集轉染后的細胞和培養液，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），并轉移至硝酸纖維素膜上；封閉液封閉1 h后，與1∶1 000稀釋的抗flag標簽單抗37 ℃溫育1 h；TBST室溫洗膜3次后，與1∶1 000稀釋的羊抗鼠IgG（HRP標記）37 ℃孵育45 min；洗膜4次后，加入底物液顯色；用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影、照相。試驗中設置轉染pDoubleEx-EGFP-flag-N-PBD1質粒的細胞作為陽性對照，設置β-actin抗體組作為內參。

2 結果與分析

2.1 重組表達質粒的構建

通過限制性內切酶酶切并回收人工合成優化后的鴨防御素基因片段，將其插入到pDoubleEx-EGFP-flag-N質粒中構建重組表達質粒。將重組質粒分別用NheⅠ和EcoRⅠ進行酶切鑒定，均可得到約6 400 bp和800 bp兩條DNA片段，片段均與預期片段大小相符（圖1），表明基因片段已插入到真核表達質粒中。

2.2 鴨防御素mRNA檢測

一步法RT-PCR結果表明，以轉染重組質粒的細胞總RNA為模板，能擴增出大小約200 bp的特異性片段，未轉染的細胞不能擴增到特異性片段（圖2），表明插入的鴨防御素基因在細胞中得到轉錄。

2.3 轉染細胞的鏡檢

轉染重組質粒36 h后，轉染組細胞長勢良好，基本鋪滿孔底。在熒光顯微鏡下，轉染細胞發出綠色熒光（圖3）。未轉染組細胞在熒光顯微鏡下無熒光。表明重組質粒被成功轉入HEK293細胞，報告基因EGFP（增強型綠熒光蛋白）已表達。

2.4 重組蛋白的Western-blot鑒定

轉染重組表達質粒的293細胞經Western-blot鑒定，結果表明，3種鴨AvBDs重組質粒轉染細胞均無明顯的表達帶，PBD1表達帶和β-actin表達帶明顯，結果見圖4，這表明3種鴨防御素未能在293細胞中表達或其表達量極低。

3 討論

禽類防御素是禽類天然免疫系統的一部分，在抵御病原微生物的侵襲中發揮著重要作用[3]。研究表明，禽類防御素對大腸桿菌、葡萄球菌、沙門氏菌和某些病毒具有抑制作用[4]。人們對禽類防御素的分子結構、生物學特性、抗微生物機理和應用正進行著越來越深入的研究。由于禽類防御素天然產量低，從機體中提取天然產物的過程復雜且產量低，這使得從人工表達及轉基因植物表達等方面對禽類防御素進行研究成為重點。目前，已報道有雞防御素[5]、鴨防御素[6]、鵝防御素[7]、鵪鶉防御素[8]等禽類防御素獲得了表達。然而，這些研究多是利用大腸桿菌或酵母菌等為表達系統。關于禽類防御素在動物細胞中的表達很少報道。動物細胞是否適合表達禽類防御素還有待研究。2010年，侯淑倩[9]報道了雞β-防御素-5在COS7細胞中的表達，但僅從mRNA水平檢測了防御素的表達情況；2011年，單艷菊等[10]利用Flp-In-293細胞表達雞β-防御素-1，也未從蛋白質水平對表達蛋白進行驗證。本研究構建了表達鴨防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12的真核表達載體，并在動物細胞HEK293中對這3種防御素進行了表達。通過檢測這3種防御素的mRNA，證實外源防御素基因成功轉錄，然而用Western-blot并沒有檢測到相應的蛋白質。這可能暗示用動物細胞大量表達禽類防御素存在一些尚待解決的技術問題。

本研究中的禽類防御素未能大量表達的原因可能有3方面：①禽類防御素分子為堿性小肽，易被蛋白酶降解[11]。目前，大部分研究采用融合表達或串聯表達的方法來表達防御素。這些表達方法可以人為增大表達蛋白的分子質量，并使其更容易形成包涵體，從而達到保護表達蛋白不被蛋白酶降解的目的。本研究為了保證防御素分子的高仿真性，只在目的蛋白的末端融合了flag標簽（共8個氨基酸），對分子量的改變較小。②外源基因在轉錄后可能發生基因沉默[12]，這是外源基因在表達過程中時常發生的現象。由于本研究中檢測到了3種禽類防御素的mRNA，但未檢出目的蛋白，因此推測可能發生了轉錄后基因沉默。宿主細胞中的一些RNA分子，比如細胞自身轉錄的某些防御素mRNA，可能對鴨防御素的mRNA造成了干擾，導致無法正常翻譯。③外源的禽類防御素可能對宿主細胞HEK293產生毒性作用，導致無法正常表達。已證實防御素對某些動物細胞具有一定的毒性作用，例如人β-防御素2對口腔癌KB細胞具有抑制作用[13]。

本研究構建了3種鴨防御素的真核表達載體，將其轉染HEK293細胞行表達，并從RNA水平和蛋白質水平對目的基因的表達情況進行了檢測。雖然表達未能成功，但為今后禽類防御素的表達研究提供了參考。

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