脫毒菜籽多肽毒理學試驗研究

◎楊 雪，李云亮，王禹程，黃姍芬，馬海樂

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

油菜籽在我國油料作物中占重要地位，年產(chǎn)量達1 400萬t以上[1]。菜籽粕是食品工業(yè)生產(chǎn)中菜籽榨油后的副產(chǎn)物，約占油菜籽的50%～55%[2]。菜籽粕中的蛋白含量高達30%～45%，其生物效價和利用率極高，甚至超過脫脂大豆粕和酪蛋白[3,4]，是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源。然而每年僅有少數(shù)菜籽粕摻入飼料使用，其余未被有效利用，造成大量經(jīng)濟損失和資源浪費。

菜籽粕中含有毒性成分，如硫甙、植酸、單寧和芥子堿等。硫甙本身無毒，但其經(jīng)芥子酶可分解成異硫氰酸酯、惡唑烷硫酮和腈等有毒物，嚴重影響菜籽粕的應用價值[5,6]，在使用前須進行脫毒處理。目前常用的脫毒方法包括物理脫毒法、化學脫毒法和生物脫毒法。有研究表明，采用硫酸溶液脫毒后菜籽粕中毒性物質(zhì)的脫除率高于90%，且蛋白質(zhì)的含量升高、氨基酸組成基本維持不變[7]。

多肽的生物學活性研究是食品科學的研究熱點之一[8,9]，有研究表明，菜籽蛋白經(jīng)過酶解形成的菜籽多肽有一定的保健功效，尤其是抗氧化活性[10]及降血壓活性[11]。此外，菜籽多肽還有其他生物學功能，如解酒[12]、抗腫瘤[13]等。因此，開發(fā)菜籽多肽有助于提高菜籽粕資源的利用[14]。而長期食用脫毒后的菜籽蛋白制備的菜籽多肽是否對機體會產(chǎn)生毒副作用還有待探索。

本試驗以小鼠為研究對象，進行急性經(jīng)口毒性試驗、鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗、骨髓細胞微核試驗和睪丸染色體畸變試驗，對脫毒菜籽多肽的食用安全性進行初步評價，為進一步的開發(fā)應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品

脫毒菜籽多肽（多肽含量≥85%，江蘇天琦生物科技有限公司，江蘇鎮(zhèn)江）。

1.1.2 菌株

經(jīng)鑒定基因型符合要求的TA97a、TA98、TA100和TA102，各菌株過夜培養(yǎng)液細菌濃度均在109個/mL或以上。

1.1.3 S9混合液

由Aroclor1254誘導的大鼠肝勻漿制成10% S9混合液。

1.1.4 試驗動物

健康ICR小鼠95只，其中雄性60只、雌性35只。分成3批進行試驗，第一批20只，雌雄各半，體重18.5～21.6 g，用于小鼠急性經(jīng)口毒性試驗。第二批50只，雌雄各半，體重25～30 g，用于小鼠骨髓細胞微核試驗。第三批25只雄性小鼠，體重25～30 g。用于小鼠睪丸染色體畸變試驗。南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供，清潔級，合格證號：SCXK（蘇）2013-0005 號。實驗動物屏障環(huán)境設(shè)施使用許可證號：SYXK（蘇）2012-0037 號。滅菌鼠飼料來源及合格證號：蘇州雙獅實驗動物飼料科技有限公司，蘇飼審（2009）05032。飼料和無菌水自由食用。

1.2 試驗方法

1.2.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗

采用最大耐受量試驗法（GB 15193.3-2014），每組雌雄小鼠各10只，設(shè)計劑量為15 g/kg·BW，分兩次灌胃給予，間隔4 h，每次灌胃容量均為20 mL/kg·BW。

1.2.2 鼠傷寒沙門菌/哺乳動物微粒體酶試驗

利用平板摻入法測定（GB 15193.4-2014），試驗共設(shè)5個劑量組，1個溶劑對照組，一個空白對照組即自發(fā)回變組，另設(shè)4個陽性對照組，陽性對照物疊氮鈉（NaN3）、敵克松（Dexon）、2-氨基芴（2-AF）和1,8-二羥基蒽醌分別用滅菌水和DMSO溶解，所用劑量分別為1.5、50、10、50 μg/皿。

1.2.3 小鼠骨髓細胞微核試驗

參照GB 15193.5-2014，小鼠分雌雄按體重隨機分入2.5、5、10 g/kg·BW各3個劑量組、1個溶劑對照組（純凈水）和1個陽性對照組（環(huán)磷酰胺40 mg/kg·BW），每組10只，雌雄各半。各組均采用30 h兩次灌胃法，每次灌胃容量為20 mL/kg·BW，第2次灌胃后6 h殺鼠，取股骨骨髓懸于小牛血清中直接涂片、固定、染色，鏡檢嗜多染紅細胞1 000個/鼠，計數(shù)具有微核的細胞，觀察嗜多染紅細胞和正染紅細胞比率（PCE/NCE）。

1.2.4 小鼠睪丸染色體畸變試驗

參照GB 15193.8-2014，分別稱取脫毒菜籽多肽2.5、5、10 g加純凈水至20 mL配制成受試劑量。陽性對照取環(huán)磷酰胺40 mg加生理鹽水至10 mL混合均勻。小鼠按體重隨機分入3個劑量組、1個溶劑對照組（純凈水）和1個陽性對照組（環(huán)磷酰胺40 mg/kg·BW），每組5只小鼠。陽性對照組連續(xù)5 d，每次灌胃容量均為20 mL/kg，每天一次。各組動物均于處死前6 h腹腔注射秋水仙素4 mg/kg，試驗第14 d殺鼠取睪丸，拉開曲細精管，低滲，固定，軟化，制片，染色，鏡檢，觀察細胞數(shù)100個/只。

1.3 統(tǒng)計學處理

各項測定指標均用spss16.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗

觀察小鼠灌胃后兩周內(nèi)的體重以及中毒表現(xiàn)，脫毒菜籽多肽對小鼠體重的影響見表1。

表1 脫毒菜籽多肽對小鼠體重的影響表

表1 脫毒菜籽多肽對小鼠體重的影響表

?

從表1可以看出，脫毒菜籽多肽對動物體重增長無明顯影響。經(jīng)口給予動物后未見明顯中毒表現(xiàn)，觀察期內(nèi)無動物死亡。脫毒菜籽多肽對雌雄小鼠經(jīng)口最大耐受劑量均大于1.5 g/kg·BW，根據(jù)小鼠急性經(jīng)口毒性分級標準，該脫毒菜籽多肽屬無毒級。

2.2 鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗

脫毒菜籽多肽對小鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗結(jié)果見表2。

表2 脫毒菜籽多肽對小鼠傷寒沙門菌/哺乳動物微粒體酶試驗結(jié)果表

表2 脫毒菜籽多肽對小鼠傷寒沙門菌/哺乳動物微粒體酶試驗結(jié)果表

?

由表2中結(jié)果可知，兩次試驗各劑量組的回變菌落數(shù)，不論加S9與否均為超過相應的溶劑對照值的兩倍，也無劑量-反應關(guān)系。劑量達5 000 μg/皿，不論加S9與否，脫毒菜籽多肽對標準測試菌株TA97a、TA98、TA100和TA102均未檢出明顯的誘變活性。

2.3 小鼠骨髓細胞微核試驗

脫毒菜籽多肽對小鼠骨髓細胞微核試驗結(jié)果見表3。

表3 脫毒菜籽多肽對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結(jié)果表

表3 脫毒菜籽多肽對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗結(jié)果表

?

各菜籽多肽受試物的微核率與溶劑對照組相比，均無顯著性差異，也無劑量-反應關(guān)系，陽性對照組微核率與溶劑對照組相比則有統(tǒng)計學顯著性差異（P＜0.01）。受試物各劑量組動物的PCE占紅細胞總數(shù)的比例不少于對照組的20%，提示骨髓紅細胞系統(tǒng)的增殖并無明顯受抑，對嗜多染紅細胞微核的觀察無明顯影響。在2.5、5、10 g/kg受試劑量下，脫毒菜籽多肽沒有對雌雄小鼠骨髓嗜多染紅細胞致微核作用。

2.4 小鼠睪丸染色體畸變試驗

脫毒菜籽多肽對小鼠睪丸染色體畸變試驗結(jié)果見表4。

表4 脫毒菜籽多肽對小鼠睪丸初級精母細胞染色體畸變試驗結(jié)果表

表4 脫毒菜籽多肽對小鼠睪丸初級精母細胞染色體畸變試驗結(jié)果表

a：斷裂、斷片、三價體、四價體等，★★：與對照值比較P＜0.01。

?

脫毒菜籽多肽各劑量組小鼠具有染色體畸變的初級精母細胞率與溶劑對照值之間均無統(tǒng)計學差異，也無劑量-反應關(guān)系。陽性對照值與溶劑對照值之間有統(tǒng)計學顯著性差異（P＜0.01）。在2.5、5、10 g/kg受試劑量下，脫毒菜籽多肽沒有對雄性小鼠睪丸初級精母細胞染色體的誘變活性。

3 討論

本文通過小鼠急性經(jīng)口毒性試驗、鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠睪丸染色體畸變試驗研究了脫毒菜籽多肽毒理學特性。急性毒性試驗中，脫毒菜籽多肽對雌雄小鼠經(jīng)口最大耐受劑量均大于15 g/kg·BW。鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗可在基因水平上反映生物體遺傳物質(zhì)的損傷情況，本實驗中，脫毒菜籽多肽的添加劑量達5 mg/皿時，加及不加S9對標準測試菌株TA97a、TA98、TA100和TA102均沒有明顯誘變活性，說明飼喂脫毒菜籽多肽以后，小鼠既沒有間接誘變活性，也沒有直接誘變活性。小鼠骨髓細胞微核試驗可以反映受試物對哺乳動物骨髓細胞染色體的作用能力，以檢測致突變物對遺傳物質(zhì)的損傷情況。小鼠睪丸染色體畸變試驗反映了生殖系統(tǒng)在外來誘變劑作用下的變異現(xiàn)象。這2項遺傳毒性試驗結(jié)果均為陰性，表明脫毒菜籽多肽對體細胞和生殖細胞沒有致突變性。

4 結(jié)論

通過小鼠急性經(jīng)口毒性試驗可知，脫毒菜籽多肽屬于無毒級；通過鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗可知，脫毒菜籽多肽對小鼠既沒有間接誘變活性，也沒有直接誘變活性；通過小鼠骨髓細胞微核試驗可知，脫毒菜籽多肽對小鼠遺傳物質(zhì)無損傷作用；通過睪丸染色體畸變試驗可知，脫毒菜籽多肽對小鼠生殖系統(tǒng)無誘變作用。

由此可得出最終結(jié)論，脫毒菜籽多肽具有良好的食用安全性，可以作為一種保健食品原料進行開發(fā)、利用。

參考文獻：

[1]劉敏佳.菜籽粕的抗營養(yǎng)因子及其脫毒研究進展[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2016，37（3）：9-12.

[2]丁 艷，李麗倩，曹 蓉，等.油菜籽餅粕中硫苷的酶解條件優(yōu)化及降解產(chǎn)物分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2014，47（2）：383-393.

[3]Berot S，Compoint J，Larre C，et al. Large scale purification of rapeseed proteins （Brassica napusl L.)[J].Journal of Chromatography B，2005，818（1）：35-42.

[4]Yoshie S Y，Wada Y，Schott M，et al.Functional and bioactive properties of rapeseed protein concentrates and sensory analysis of food application with rapeseed protein concentrates[J]. LWT-Food Science and Technology，2006，39（5）：503-512.

[5]邱良偉，顧擁建，沙文鋒，等.復合微生物固態(tài)發(fā)酵菜籽粕的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2015，43（3）：209-211.

[6]羅倉學，史 蘭，李振堯.菜籽粕脫毒及菜籽蛋白提取工藝優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵科技，2013，19（6）：50-54.

[7]蘭文菊，彭密軍，彭 勝，等.酸溶液對菜籽粕脫毒工藝探討[J].中國糧油學報，2012，27（11）：67-71.

[8]Yoon K A，Kim K，Kim A Y，et al.Selective antitumor activities of venom peptides from the lesser paper wasp Parapolybia varia[J]. Journal of Asia-Pacific Entomology，2016，19（3）：821-828.

[9]Kim H，Jang J H，Kim S C，et al.Enhancement of the antimicrobial activity and selectivity of GNU7 against Gramnegative bacteria by fusion with LPS-targeting peptide[J].Peptides，2016，82（5）：60-66.

[10]He Rong，Ju Xingrong，Yuan Jian，et al. Antioxidant activities of rapeseed peptides produced by solid state fermentation[J].Food Research International，2012，49（1）：432-438.

[11]Makinen S，Streng T，Larsen L B，et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory and antihypertensive properties of potato and rapeseed protein-derived peptides[J].Journal of Functional Foods，2016，25：160-173.

[12]王薇星.菜籽蛋白的制備及其酶解產(chǎn)物的醒酒功效[D].金華：浙江師范大學，2012.

[13]曾曉波，吳謀成，李小定，等.菜籽肽對S180腫瘤細胞體外生長影響的研究[J].營養(yǎng)學報，2004，26（3）：216-219.

[14]Wang Bei，Meng Tingting，Ma Haile，et al.Mechanism study of dual-frequency ultrasound assisted enzymolysis on rapeseed protein by immobilized Alcalase[J].Ultrasonics Sonochemistry，2016，32（3）：307-313.