純凈水對斑馬魚幼魚生長發育的影響

◎朱加進，蔡 赫

（浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310000）

較其他模式生物，斑馬魚具有完整的器官和系統，且同人類基因組具有高達87%的同源性[1]，它的體積小、繁殖能力強、生長發育迅速、養殖成本低，可縮短藥物篩選實驗的周期、提高篩選效率，因此備受藥學研究者的青睞，如利用斑馬魚建立疾病模型、進行藥物活性成分的高通量篩選等。在病理學方面，由于斑馬魚突變技術的研究發展，研究者們建立了斑馬魚遺傳圖譜，分析了有價值的突變體，發展了轉基因斑馬魚技術，這些都成為毒理學研究的優良資源。目前，斑馬魚已被廣泛應用于遺傳和發育毒理學、環境毒理學、病理毒理學、藥物毒理學等毒理學領域，并展現出其獨特的優勢[2,3]。

水環境對斑馬魚的生長、發育及行為學方面有很大的影響，國際標準組織（ISO）已將斑馬魚推薦為河水毒性實驗魚種并制定了相應的標準（ISO 07346）。我國參照國際標準，于1991年出臺了國家標準《水質物質對淡水魚（斑馬魚）急性毒性測定方法》（GB/T 13267-1991），使用斑馬魚進行水質安全性的檢測已獲國內外認可并得到了廣泛應用。

目前市場上的飲用水品牌琳瑯滿目，但從加工工藝來看，主要可分為天然水和純凈水兩類。天然水主要以地表的山、河、湖、泊和地下泉水為主要水源，經過簡單的處理工藝，在去除原水中極少的雜質和有害物質的同時保存原水中對人體有益的礦物質元素。純凈水主要以市政自來水為水源，經過反滲透工藝在除去有害物質的同時也基本完全去除各種礦物元素。飲用水中礦物離子對機體的重要性已有很多報道，但運用斑馬魚模型來研究飲用水中礦物元素對機體健康影響在國內外還鮮有報道。因此，本研究采用斑馬魚模型，對水中礦物質離子對機體生長發育的重要性作初步評價并從形態學角度探究純凈水對斑馬魚的致畸作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

斑馬魚受精卵由浙江大學生命科學學院提供，為野生AB型。

1.2 試劑及其配制

養魚用水配制：準確稱取2.264 0 g NaCl，0.074 5 g KCl，0.405 1 g HEPES和0.266 4 g無水CaCl2，用蒸餾水于1 L容量瓶定容后用3 M NaOH調pH至7.2后備用。

4%甲基纖維素配制：準備稱取4 g甲基纖維素于100 mL的熱水中攪拌溶解后于4 ℃冰箱中冷藏過夜后備用。

天然水及純凈水，均購于市場。

1.3 儀器

體式顯微鏡（奧林巴斯），心率血流測試系統（viewpoint公司）。

1.4 實驗方法

將野生AB型斑馬魚受精卵置于盛有養魚用水的培養皿中于28.5 ℃培養箱中孵化，2 dpf后用體式顯微鏡剔除發育異常的斑馬魚幼魚。本次試驗對象為3組水樣，分別為純凈水組，天然水組和正常對照組（養魚用水）。取六孔板，每孔吸入30尾2 dpf幼魚并分別加入10 mL的上述水樣，每組樣品一個復孔于28.5 ℃培養箱中孵化，24 h換液一次。

在5 dpf時從每組樣品中隨機挑選10尾魚用4 %甲基纖維素溶液固定后用體式顯微鏡和心率血流測試系統對斑馬魚幼魚生長發育（體長、身體側面投影、卵黃囊面積、眼大小和側翻率）及致畸性等指標（脊柱彎曲、心率）進行觀察分析。

1.5 數據處理

本文中數據均采用spss16.0進行獨立t-檢驗分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 純凈水對斑馬魚幼魚生長發育的影響

純凈水對斑馬魚幼魚生長發育的影響（見圖1）。

圖1 純凈水對斑馬魚幼魚生長發育的影響圖

如圖1所示，純凈水組斑馬魚的體長、身體側面投影、眼大小分別為：

（3.59±0.12）mm

（1.06±0.07）mm2

（0.24±0.02）mm2

均顯著低于天然水組的：

（3.72±0.14）mm

（1.15±0.05）mm2

（0.27±0.02）mm2

與正常對照組的：

（3.74±0.12）mm

（1.15±0.06）mm2

（0.26±0.02）mm2

卵黃囊面積純凈水組為（0.55±0.09）mm2，顯著高于天然水組的（0.41±0.09）mm2及正常對照組的（0.44±0.10）mm2。在上述指標中，天然水組與正常對照組均無統計學差異。由此可見，與其他兩組相比，純凈水能顯著延緩斑馬魚幼魚的生長發育。

2.2 純凈水對斑馬魚的致畸性的研究結果

如圖2所示，純凈水組斑馬魚的心率為（126.6±8.54）bpm，顯著低于天然水組（141.6±5.56）bpm及正常對照組（142.4±5.94）bpm，天然水組與正常對照組無差異。

圖2 純凈水對斑馬魚心率的影響圖

如圖3所示，養殖在純凈水組中的斑馬魚幼魚有脊柱彎曲的現象。由此可知，純凈水對斑馬魚幼魚有明顯的致畸作用。

3 討論

礦物元素與機體健康有著重要的關系。鈣是人體必需的常量元素之一，它不僅是骨骼組成的主要構成部分，在機體生長發育過程中也起著重要的作用[4]。Zemel[5]等人通過實驗發現降低細胞內鈣離子濃度會抑制脂肪分解代謝進而影響脂肪等物質的吸收。除鈣外，鎂也是人體細胞內重要的元素，黃永祥 等[6]研究表明鎂具有多種特殊的生理功能，它能激活體內多種酶、抑制神經異常興奮性、維持核酸的結構的穩定性、參與體內蛋白質的合成、肌肉收縮及體溫調節，同時鎂影響鉀、鈉、鈣離子細胞內外移動的通道，并有維持生物膜電位的作用。

飲用天然水由其處理工藝的原因，在除去少量有害物質的同時還保留了大部門對人體有益鈣、鎂元素和其他多種微量元素。水中礦物元素對機體健康的影響已有大量文獻報道，陳榮河 等[7]對3月齡的ICR小鼠進行90 d的研究表明，長期飲用純凈水對小鼠的抗氧化酶及脂代謝指標均有一定的影響。周宇紅 等[8]對小鼠進行近4個月的跟蹤考察實驗，發現與飲用天然水相比，長期飲用純凈水會顯著延緩仔鼠的生長發育。胡啟之 等[9]對4月齡的ICR小鼠3個多月的跟蹤考察實驗也發現也發現長期飲用純凈水具有延遲仔鼠生長發育的趨勢。

以前的研究學者基本上是用大小鼠作為模式動物進行礦物離子與機體健康的研究，但周期較長、成本高，本實驗運用考察周期更短的斑馬魚模型（考察周期僅為3 d）對水中礦物元素對機體健康的影響進行研究。據本實驗可知，純凈水能延遲斑馬魚幼魚的生長發育，這與前人用大小鼠研究的結論“長期飲用純凈水具有延遲仔鼠生長發育”基本一致。

在本次實驗過程中發現，純凈水能顯著降低斑馬魚幼魚的心率并伴有脊柱彎曲等致畸現象出現，這可能與純凈水中缺乏鈣、鎂等礦物元素有關。有文獻表明，長期缺鈣可引起嬰兒出現佝僂病的危險，缺鎂可引起機體的心率失常[10,11]。由此可見，運用斑馬魚作為模式動物能在較短的時間內更全面地評價純凈水對機體健康的影響。

參考文獻：

[1]常 嘉，陸 亮，林金杏，等.斑馬魚胚胎發育毒性評價方法的建立[J].世界臨床藥物，2013，34（11）：660-664.

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[3]李乙根，黃文瑾，黃 誠.斑馬魚在新藥發現中的應用[J].生命科學，2011，23（3）：273-278.

[4]姚 莉，段玉峰.鈣在人體中平衡與健康[J].廣東微量元素科學，2004，11（3）：6-11.

[5]Zemel MB，Shi H，Greer B，et al. Regulation of adiposity by dietary alcium[J].FASEB J,2000，（4）：1132-1138.

[6]黃永祥.鎂與人的健康[J].中外健康文摘，2009（11）：234-235.

[7]陳榮河，陳 楚，沈惠真，等.水質對小鼠肥胖相關指標影響[J]中國公共衛生，2014，30（4）：454-456.

[8]周宇紅，耿桂英，馮水全，等.新型飲水對小鼠繁殖及抗氧化酶活性的影響[J]2003，19（12）：1429-1430.

[9]胡啟之，俞 萍.低鈣飼料和純水對小鼠胚胎和仔鼠生長發育的影響[J]環境與職業醫學，2002，19（3）：195.

[10]高學習.佝僂病患兒微量元素分析[J].臨床醫學，2011，30（28）：61.

[11]雷潤華.鎂在心腦血管疾病防治中的應用[J].中國民族民間醫藥，2009，18（20）：122.