青蒿乙素、青蒿酸和東莨菪內酯三組分對青蒿素在瘧疾小鼠體內藥動學行為的影響

張超　仇峰　李靜　王滿元　龔慕辛

100069　北京，首都醫科大學中醫藥學院[張超(碩士研究生)、仇峰、李靜、王滿元、龔慕辛]

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·論著·

青蒿乙素、青蒿酸和東莨菪內酯三組分對青蒿素在瘧疾小鼠體內藥動學行為的影響

張超仇峰李靜王滿元龔慕辛

100069北京，首都醫科大學中醫藥學院[張超(碩士研究生)、仇峰、李靜、王滿元、龔慕辛]

【摘要】目的探究青蒿乙素、青蒿酸和東莨菪內酯三組分在瘧疾小鼠體內對青蒿素抗瘧增效作用在藥物動力學方面可能的影響及其規律，為開發新型基于青蒿素類抗瘧藥的聯合治療方案藥物奠定基礎。方法分別對瘧疾小鼠灌胃給予青蒿素(100 mg/kg)和青蒿素、青蒿酸、青蒿乙素和東莨菪內酯聯用(每種組分各100 mg/kg)，于給藥后不同時間點采集血漿，樣品經液-液萃取后，采用HPLC-MS/MS法測定藥物濃度。結果與青蒿素單用比較，青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸和東莨菪內酯聯用組青蒿素的最大血藥濃度由924 ng/mL 增加到1065 ng/mL，AUC((0-t))(1893 h×ng/mL)明顯高于青蒿素單用組(661 h×ng/mL)，半衰期延長，血漿清除率下降了65%。結論青蒿乙素、青蒿酸和東莨菪內酯可顯著影響青蒿素的藥物動力學行為。

【關鍵詞】青蒿素；青蒿；協同增效組分；藥物動力學；小鼠瘧疾模型

近年來，艾滋病、結核和瘧疾被WHO列為對人類健康威脅最為嚴重的三大傳染病。根據WHO 2015年世界瘧疾報告，全球大約32億人面臨瘧疾風險，2015年仍有約2.14億瘧疾新病例，死亡大約43.8萬人[1]。長期以來，藥物治療是人類抗擊瘧疾的主要方法和有效途徑。當前，青蒿素類藥物發揮著挽救瘧疾患者生命的重要作用。2003年版《國際藥典》中收載的青蒿素類藥物有：蒿甲醚原料、注射液，青蒿素原料、片劑、膠囊，蒿乙醚原料、注射液，雙氫青蒿素原料、片劑，青蒿琥酯原料、片劑。為提高青蒿素類藥物的臨床療效，降低瘧原蟲再燃率，延緩耐藥性的產生，WHO目前推薦基于青蒿素類抗瘧藥的聯合治療方案(artemisinin-based combination therapies，ACTs)，分別為蒿甲醚+本芴醇、青蒿琥酯+阿莫地喹、青蒿琥酯+甲氟喹、青蒿琥酯+磺胺多辛(周效磺胺)/乙胺嘧啶以及雙氫青蒿素+哌喹[2]，這些ACTs組合均為青蒿素類藥物與一種已產生耐藥性的抗瘧藥聯合應用的組合。作為一類自2001年開始就廣泛使用的瘧疾治療方案，目前ACTs的耐藥現狀不容樂觀，柬埔寨與泰國的邊境地區、緬甸和越南等地已經確診出現了惡性瘧原蟲對青蒿素類藥物耐藥[3]。這種耐藥性雖然沒有導致青蒿素類藥物治療的徹底失敗，但卻減緩了從患者血液中清除惡性瘧原蟲的速度。WHO認為，在青蒿素耐藥性傳播到高感染地區之前，遏制或消除耐藥性的機會其實十分有限[1]。前期發現：青蒿中含量較高的青蒿酸、青蒿乙素和東莨菪內酯對青蒿素的抗瘧藥效有明顯的增效作用(該藥物組合簡稱青蒿四組分，青蒿乙素、青蒿酸和東莨菪內酯三組分單用或伍用沒有觀察到明顯抗瘧活性)[4]。本課題組針對“以1∶1∶1∶1質量比配伍時青蒿四組分體系中青蒿素增效4倍的現象”開展了系列研究。前期研究結果提示，青蒿素屬于難溶易吸收藥物，雖不能完全排除藥效環節的增效作用，但青蒿素四組分體系的增效現象很可能是通過代謝環節實現的，無抗瘧活性的天然組分可以增強青蒿素的藥效。臨床和基礎研究證實，瘧疾感染會導致宿主下調肝藥酶CYP450的表達，導致藥物首過代謝減少[5]。為了進一步深入探究青蒿四組分體系的增效機制，開展了青蒿多組分體系在約氏瘧原蟲(plasmodium yoelii)感染小鼠體內藥物動力學特征的研究，為發展新的抗青蒿素耐藥治療策略提供參考。

1材料與方法

1.1儀器

6410型三重四級桿串聯質譜儀(美國Agilent科技有限公司)；低溫冷凍離心機(Sigma公司，3K15)；渦旋混合器(天津藥典標準儀器廠，2H-2)；十萬分之一電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司，BT25S)。

1.2藥品與試劑

青蒿素、青蒿乙素和青蒿酸(均為本實驗室自制，經檢測純度均大于98.4%)；東莨菪內酯(日本東京化成工業株式會社，純度為98%)；內標物丁螺環酮(Sigma公司，批號BCBL7606V，純度為99.3%)。

色譜級甲醇(Fisher公司，批號140098)；色譜級乙腈(Fisher公司，批號124984)；色譜級甲酸(Sigma公司，批號0001394882)；甲基叔丁基醚(天津市福晨化學試劑廠，批號20150120)；吐溫-80(天津市化學試劑六廠分廠，批號20110520)；羧甲基纖維素鈉(北京鳳禮精求商貿有限責任公司，批號20130307)。

1.3實驗動物

SPF級健康ICR小鼠，雄性，體質量(20±2) g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2012-0001。

1.4色譜-質譜條件

色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax XDB-C18柱(50 mm×2.1 mm，3.5 μm)；流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脫，0～1分鐘，5% B相；1～1.1分鐘，5%～10% B相；1.1～5分鐘，10%～95% B相；5～6分鐘，95% B相；6～6.1分鐘，95%～5% B相；6.1～10分鐘，5% B相；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

質譜條件：采用ESI電離源，MRM檢測模式，青蒿素、青蒿乙素和東莨菪內酯采用正離子電離模式，青蒿酸采用負離子電離模式。離子噴霧電壓為4.0 kV，加熱毛細管溫度300 ℃，輔助加熱氣壓為30 psi，霧化氣壓為30 psi，青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內酯和內標丁螺環酮的解簇電壓(DP)分別為100 V、120 V、130 V、120 V、100 V；碰撞能量(CE)分別為9 eV、10 eV、3 eV、25 eV、40 eV；用于定量分析的離子對分別為：283.2→247.1，249.1→189.1，232.8→232.8，193.0→133.0，386.3→122.1。

1.5實驗方案和樣品采集

取SPF級健康ICR小鼠96只，小鼠腹腔接種1×107個被瘧原蟲寄生的紅細胞，接種3天后(當小鼠瘧疾感染率達到20%時)，隨機分為2大組：即青蒿素單用組(100 mg/kg)、青蒿素+青蒿酸+青蒿乙素+東莨菪內酯聯用組(每種組分各100 mg/kg)，每只小鼠按照所在藥物組別灌胃給藥。每大組再分為8小組(每一組為一個取樣時間點所需動物)，每個時間點隨機選取6只小鼠摘眼球取血。給藥前禁食12小時，自由飲水，給藥后5分鐘、15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、5小時、8小時和12小時摘眼球取血300 μL，收集血液樣品于預冷肝素化離心管，立即搖勻置于冰上，3000 rpm、4 ℃離心10分鐘，取上清血漿樣品于1.5 mL離心管中，-80℃保存備用。采用LC-MS/MS法測定血漿中相關成分的濃度。

表1　采用LC-MS/MS法測定ICR小鼠血漿中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸和

1.6血漿樣品處理

取血漿樣品50 μL，依次加入甲醇-水(20:80，v/v)混合溶液10 μL、內標溶液(100 ng/mL丁螺環酮)10 μL、0.1%的甲酸溶液10 μL和甲基叔丁基醚(MTBE)400 μL，渦旋混合1分鐘，3500 rpm離心10分鐘，取上清液300 μL，氮氣吹干，殘留物加入乙腈-水(1:1，v/v)混合溶液100 μL溶解，渦旋混合1分鐘，以LC-MS/MS法進行測定。

2結果

2.1青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內酯在小鼠體內的LC-MS/MS方法學驗證

血漿中的內源性雜質不干擾青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內酯的測定，青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內酯和內標丁螺環酮的保留時間分別為6.91分鐘、6.68分鐘、7.59分鐘、5.20分鐘和5.32分鐘；以藥物濃度(C)為橫坐標(X)，對照品峰面積與內標峰面積比值為縱坐標(Y)，用加權(1/C2)最小二乘法進行線性回歸，得到回歸方程，見表1；青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸和東莨菪內酯的低、中、高三個濃度日內及日間精密度RSD均<15%(n=6)；青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內酯經歷3個冷凍解凍循環、于-80 ℃冰箱冷凍30天、于20 ℃放置24小時后穩定性良好；青蒿素的回收率在89.5%～99.3%，青蒿乙素的回收率在86.9%～99.0%，青蒿酸的回收率在93.4%～99.3%，東莨菪內酯的回收率在85.2%～91.6%。樣品處理方法符合規定，可用于血漿樣品中青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內酯的分析測定。

2.2青蒿素單用及四組分聯用在瘧疾小鼠體內藥動學研究

2.2.1青蒿素單用及四組分聯用在瘧疾小鼠體內青蒿素的血藥濃度-時間曲線及藥物動力學參數青蒿素單用及四組分聯用在瘧疾小鼠體內青蒿素的血藥濃度-時間曲線見圖1，采用WinNonlin軟件計算藥動學參數，結果見表2。

注：無顯著性差異(aP>0.05)；顯著性差異(bP<0.05)；極顯著性差異(cP<0.01)

圖1　青蒿素單用及四組分聯用在瘧疾小鼠體內

與青蒿素單用相比，四組分聯用后瘧疾小鼠體內青蒿素的血藥濃度增大，半衰期延長，Cmax升高，Vd、CL降低，生物利用度是青蒿素單用的2.86倍。

2.2.2瘧疾小鼠體內青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內酯的藥物動力學參數瘧疾小鼠灌胃給予青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內酯組合物后青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內酯的藥代動力學參數見表3。

表3　四組分聯用在瘧疾小鼠體內青蒿乙素、

3討論

青蒿素是含過氧橋的倍半萜內酯類化合物，分子結構中缺少共軛體系，采用常規紫外檢測器難以達到定量分析生物樣品的目的。本實驗采用液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)建立了青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸、東莨菪內酯在瘧疾小鼠血漿中藥物濃度的測定方法，同時為了提高分析方法的準確性，減少實驗誤差，選擇丁螺環酮作為內標，避免了在樣品處理及進樣過程中帶來的誤差。在摸索青蒿酸的質譜條件中發現，當給予較大碰撞能量時，青蒿酸母離子全部成為碎片，沒有特征子離子，而采用較小碰撞能量時，只有母離子，沒有碎片離子，故最終采用較小碰撞能量，只檢測母離子進行藥物濃度測定。本實驗比較了乙腈沉淀蛋白法、甲醇沉淀蛋白法、甲基叔丁基醚萃取法和二氯甲烷萃取法的提取效果。結果發現采用沉淀蛋白法處理樣品檢測不到青蒿素，采用液-液萃取法處理樣品四種組分均可被檢測到，且甲基叔丁基醚的提取率高于二氯甲烷的提取率，故實驗最終采用甲基叔丁基醚萃取法處理樣品。

無有效抗瘧藥對實現全球控制瘧疾將是一場災難，一旦瘧原蟲對目前的ACTs產生耐藥性，有可能導致與瘧疾有關的死亡人數大幅攀升。由于沒有其他抗瘧藥能具有ACTs的藥效和依從性，近期的瘧疾控制工作仍然面臨很大的不確定性，發展新型瘧疾治療藥物具有現實緊迫性。另一方面，由于受到經濟發展狀況以及傳統習俗的影響，青蒿素的不合理使用仍在繼續。非洲多地的瘧疾患者由于種種原因很難獲得ACTs藥物，致使這些瘧疾高發區的患者還在使用基于青蒿原植物開發的號稱對瘧疾有預防和治療作用的植物藥[6-7]。WHO認為這些植物藥中青蒿素的含量遠遠低于瘧疾治療的有效劑量，可能會促進瘧原蟲發展青蒿素的耐藥性[8]。但是，多年來這個問題并沒有解決，現實中仍然在使用這些青蒿植物制劑。如何能夠更合理地使用天然青蒿素，延緩或避免青蒿素類藥物的抗藥性問題，應該得到更多的關注和研究。

課題組前期探討了青蒿乙素、青蒿酸和東莨菪內酯三組分對正常小鼠體內青蒿素藥動學行為的影響。綜合分析正常和瘧疾小鼠模型的結果，表明正常和瘧疾小鼠灌胃給予100 mg/kg青蒿素后，正常小鼠體內青蒿素的血藥濃度大于瘧疾小鼠體內青蒿素濃度，正常小鼠組青蒿素的Cmax、AUC(0-t)均略高于瘧疾小鼠組，達峰時間相同；正常和瘧疾小鼠灌胃四組分后，正常小鼠體內青蒿素的濃度大于瘧疾小鼠體內青蒿素濃度，正常小鼠組青蒿素的Cmax、AUC(0-t)均略高于瘧疾小鼠組，達峰時間滯后。表明青蒿素單體相同劑量單次給藥，在正常和瘧疾小鼠的藥物動力學存在差異。一般認為，瘧疾感染會導致青蒿素類藥物的代謝減少，體內血藥濃度相對增高[5]。本次實驗的結果提示，除代謝環節以外，青蒿素的體內過程同時也受其他環節的影響，比如蛋白結合過程等。前期課題組研究表明與青蒿素單獨作用相比，四組分聯用對牛血清白蛋白的猝滅常數和結合常數均增大，青蒿素體內蛋白存貯及轉運發生改變，影響青蒿素的藥物動力學行為[9]。

鑒于青蒿素類藥物耐藥性發展的嚴峻形勢，研究人員應高度重視新型抗瘧藥物和治療策略的研究。筆者認為通過深入研究青蒿“以1∶1∶1∶1質量比配伍時青蒿四組分體系中青蒿素增效4倍的現象”，有助于發展新的抗瘧策略，能夠為合理應用青蒿植物制劑，發展低耐藥性天然ACTs組分藥物奠定基礎。本實驗結果顯示，與青蒿素單用比較，青蒿素、青蒿乙素、青蒿酸和東莨菪內酯聯用組青蒿素在約氏瘧原蟲感染小鼠體內的最大血藥濃度由924 ng/mL增加到1065 ng/mL，AUC(0-t)(1893 h×ng/mL)明顯高于青蒿素單用組(661 h×ng/mL)，半衰期延長，血漿清除率下降了65%，確證了青蒿素天然協同組分通過改變其藥物動力學性質來提高抗瘧作用的學術觀點，提示了天然組分干預青蒿素的體內過程是一種可行的增效策略。

參考文獻

[1]World Health Organization. World Malaria Report 2015 [R].Geneva：WHO，2015.

[2]World Health Organization. Guidelines for the treatment of malaria(Third edition)[R]. Geneva：WHO，2015.

[3]趙紹敏，王滿元. 惡性瘧原蟲對青蒿素類藥物產生耐藥性的全球現狀和基礎研究[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2014，32(5)：81-85.

[4]紀曉光，孫雅潔，王京燕，等.青蒿化學成分及其與青蒿素伍用對鼠瘧的藥效學研究[J]. 寄生蟲與昆蟲學報，2008，15(4)：198-201.

[5]De-Oliveira AC，Da-Matta AC，Paumgartten FJ. Plasmodium berghei (ANKA)：infection induces CYP2A5 and 2E1 while depressing other CYP isoforms in the mouse liver[J]. Experimental Parasitology，2006，113(4)：256-261.

[6]Weathers PJ，Arsenault PR，Covello PS，et al. Artemisinin production in Artemisia annua：studies in planta and results of a novel delivery method for treating malaria and other neglected diseases [J]. Phytochemistry Reviews，2011，10(2)：173-183.

[7]Abolaji AO，Eteng MU，Ebong PE，et al. A safety assessment of the antimalarial herb Artemisia annua during pregnancy in wistar rats [J]. Phytotherapy Research，2013，27(5)：647-654.

[8]World Health Organization. WHO position Statement: effectiveness of non-pharmaceutical forms of Artemisia annua L. against malaria [R].Geneva：WHO，2012.

[9]王滿元，張超，李靜，等. 青蒿截瘧組合物與牛血清白蛋白的相互作用[J]. 高等學校化學學報，2014，35(2)：309-313.

(本文編輯： 董歷華)

The effects of arteannuin B,arteannuic acid and scopoletinon pharmacokinetics of artemisinin in mice infected by Plasmodium yoelii

ZHANGChao，QIUFeng，LIJing，etal.

SchoolofTraditionalChineseMedicine，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the antimalaria synergistic effects of arteannuin B, arteannuic acid and scopoletin on the pharmacokinetics of artemisinin in mice infected by Plasmodium yoelii. MethodMice infected by Plasmodium yoelii were given artemisinin or a combination of artemisinin、arteannuin B、arteannuic acid and scopoletin. Blood samples were collected at different time intervals and extracted by liquid-liquid extraction. The contents in plasma were detected by HPLC-MS/MS method. ResultsCompared to single artemisinin group, the C(max) of the combination group was increased from 924 ng/mL to 1065 ng/mL,AUC((0-t))(1893 h×ng/mL), and the maximum plasma concentration was significantly higher than that of single artemisinin group (661 h×ng/mL), the biological half life was extended, and the CLtot was reduced at a proportion of 65%. ConclutionArteannuin B、arteannuic acid and scopoletin can obviously affect pharmacokinetic of artemisinin in mice infected by Plasmodium yoelii.

【Key words】Artemisinin；Artemisia annua L.；Synergistic components；Pharmacokinetic；Mouse model of malaria

(收稿日期：2016-02-29)

Corresponding author:WANG Man-yuan， E-mail： wangmyjun@163.com；GONG Mu-xin，gongmuxin@126.com

【中圖分類號】R285.5

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.04.003

作者簡介：張超(1986- )，女，2012年在讀碩士研究生。研究方向：中藥藥物動力學研究。E-mail：13426423780@163.com通訊作者：王滿元(1976- )，博士，副教授，碩士生導師。研究方向：中藥藥物動力學研究。E-mail: wangmyjun@163.com；龔慕辛(1968- )，女，博士，教授，博士生導師。研究方向：中藥藥物動力學研究。E-mail: gongmuxin@126.com

基金項目：國家自然科學基金(81573682，81102752)；北京市自然科學基金(2112010)