星點-效應面法優化芍藥苷醇質體制備工藝

馮健男　杜守穎　白潔　陸洋　李鵬躍　武慧超

100102　北京中醫藥大學中藥學院[馮健男(碩士研究生)、杜守穎、白潔、陸洋、李鵬躍、武慧超]

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星點-效應面法優化芍藥苷醇質體制備工藝

馮健男杜守穎白潔陸洋李鵬躍武慧超

100102北京中醫藥大學中藥學院[馮健男(碩士研究生)、杜守穎、白潔、陸洋、李鵬躍、武慧超]

【摘要】目的Box-Behnken效應面法優化芍藥苷醇質體的制備工藝。方法采用逆相蒸發法制備芍藥苷醇質體。以磷脂與膽固醇比例(X1)、磷脂濃度(X2)、芍藥苷濃度(X3)為考察因素，包封率(Y)為評價指標，采用Box-Behnken效應面法對處方工藝進行優化。結果最佳處方為磷脂與膽固醇比例(mg/mg)=5.0，磷脂濃度(mg/mL)=18.0 mg/mL，芍藥苷濃度(mg/mL)=5.2 mg/mL。包封率為(44.27±0.27)%，標準偏差均小于10%；粒徑為(167.77±14.91)nm，多分散系數為(0.41±0.20)(n=3)，變形性良好。結論采用Box-Behnken效應面法對芍藥苷醇質體處方進行優化是可行和有效的。

【關鍵詞】芍藥苷；醇質體；Box-Behnken效應面法；粒徑；變形性

芍藥苷(paeoniflorin，PF)作為白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)的主要活性成分，在臨床上可用來治療類風濕性關節炎[1]。實驗結果表明，芍藥苷可以通過抑制白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的分泌抑制大鼠佐劑性關節炎的原發和繼發性炎癥[2]。有文獻報道[3-4]，芍藥苷微乳在降低關節炎指數、下調增高的T細胞和B細胞增殖反應、促進T細胞分泌IL-2等方面的作用較明顯。

然而藥代動力學表明芍藥苷的口服生物利用度極低[5-6]，單獨給大鼠灌胃芍藥苷，其生物利用度只有0.3%；同時由于小腸的滲透性較差，導致芍藥苷吸收效果差[7]。芍藥苷的半衰期為(88.87±5.3)分鐘[8]，因此，臨床治療關節炎時，需要多次、長期給藥以達到有效的關節腔濃度，服用次數每天需3次，每天用量達600 mg(以芍藥苷計)，平均用藥周期達48天[9]。因此為充分發揮芍藥苷的藥效，需改變傳統口服給藥方式。

醇質體是一種含醇脂質體。醇質體在傳遞過程中，一方面可能與角質層脂質融合將藥物直接釋放到細胞內發揮作用，另外醇質體還可以通過變形透過比自身小的角質層細胞間隙并進入血液循環，易于到達皮膚深部，提高藥物的經皮速率，增加藥物在皮膚內的滯留時間[10]。本實驗擬制備高滲透性芍藥苷醇質體載藥系統，以充分發揮芍藥苷的藥效，為后期新型透皮給藥系統的研究提供參考和依據。

1材料

日本島津高效液相色譜儀(LC-20AT四元泵、Model 1690柱溫箱、SPD-20A紫外檢測器)；KQ5200DA型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Sartorius BS110S型電子分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；SCIENTZ IID型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；渦旋混合器(大龍興創實驗儀器有限公司)；RE-52AA旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；Ultracel YM-30超濾管(Millipore)；Zetasize Nano ZS納米粒度儀(英國 Malvern公司)；恒溫磁力攪拌器(金壇市鴻科儀器廠)；氣體減壓器(上海減壓器廠有限公司)；純氮氣(氧立來有限公司)。

芍藥苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110736-201438)；芍藥苷提取物(≥98%，南京澤朗生物科技有限公司)；大豆磷脂酰膽堿S-100(Lipoid S 100，德國Lipoid公司，批號F20090050)；膽固醇(Cholesterol，美國Amresco公司)；純凈水(娃哈哈集團有限公司)；無水乙醇(北京化工廠)；無水乙醚(北京化工廠)；其余試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1醇質體的制備

將磷脂和膽固醇的無水乙醚溶液作為油相；于室溫下將芍藥苷的醇溶液加入油相中，搖勻后冰浴探頭式超聲，使形成油包水型乳劑；將上述乳劑快速轉移至250 mL旋轉蒸發瓶中，室溫減壓蒸發至凝膠狀；渦旋使凝膠部分塌陷，減壓蒸發殘留乙醚得醇質體混懸液；探頭式超聲，即得。4℃遮光密閉保存。

2.2包封率的測定

2.2.1色譜條件色譜柱：Merck C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.4%冰醋酸溶液(14：86)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃。

2.2.2低速離心-超濾法測定包封率精密移取醇質體0.4 mL，置于截留分子量為30 kd的超濾離心管6000 rpm[11]中，離心30分鐘，吸取0.2 mL濾液，定容至2 mL，超聲處理后，測定芍藥苷含量為W1；精密移取醇質體溶液0.2 mL，加甲醇定容至5.0 mL，超聲溶解，測定芍藥苷含量為W2，計算包封率公式為EE%=(1-W1/W2)×100%。

2.3芍藥苷醇質體的單因素考察

以包封率為指標，分別對磷脂和膽固醇質量比、磷脂濃度和芍藥苷濃度進行單因素考察。結果顯示：隨著磷脂和膽固醇質量比的增加包封率逐漸增大，當磷脂和膽固醇比例為5∶1時，包封率最高為(24.85±4.14)%；隨著磷脂濃度的增加，包封率也逐漸增大，當磷脂濃度為13.6 mg/mL時，芍藥苷濃度為2.8 mg/mL時，包封率達到最大為(36.87±5.11)%。

2.4Box-Behnken法優化醇質體處方

2.4.1Box-Behnken 法分析因素水平的選取和試驗設計在單因素考察的基礎上，選擇對芍藥苷醇質體包封率影響顯著的三個因素：磷脂與膽固醇比例(X1)、磷脂濃度(X2)、芍藥苷濃度(X3)作為因素，設計因素水平見表1。以包封率(Y)作為響應值，共設計了17次試驗。試驗結果見表2。

表1　Box-Behnken設計因素水平表

2.4.2多元二項式模型回歸擬合結果根據各項指標F檢驗的結果，再采用Design-Expert 8.0進行二次擬合，得到如下簡化模型：Y=42.87+0.67×X1+1.65×X2-3.50×X3+0.83×X1×X2+0.47×X1×X3-3.11×X2×X3-21.34×X12-17.44×X22-12.70×X32(R2=0.9777)。

通過方程可以看出，在所選取的各因素水平范圍內，對芍藥苷醇質體包封率的影響為：X3>X2>X1，同時各因素存在交互作用。

2.4.3方差和顯著性檢驗方程Y的R2為0.9777，方差分析結果顯示Y失擬檢驗的P>0.05，說明方程Y回歸模型擬合情況理想，其校正決定系數Radj2為0.9490，表明模型響應值的變化有94.90%來源于自變量，實驗誤差較小，可較好地描述各因素與響應值之間的關系，故可以準確分析和預測包封率；顯著性檢驗可知，模型的一次項中，X3(芍藥苷濃度)最顯著(P=0.0360)；二次項X12和X22(P<0.0001)極顯著，X32(P<0.05)顯著。

表2　Box-Behnken 實驗設計及響應值(n=3)

2.4.4工藝參數預測和優化根據二次多項回歸方程擬合結果，固定其中一個因素水平，即作為中心點值，繪出Y與其他兩個因素的三維效應曲面圖和等高線圖，預測芍藥苷醇質體最佳處方配比，見圖1。

從圖1三維曲面圖可看出，在所選取的各因素水平范圍內，醇質體包封率在X1值、X2值和X3值均存在極大值。當磷脂和膽固醇比例(X1)值大于5時，Y值隨著X1值的增大而減小；當磷脂濃度(X2)值大于17 mg/mL時，Y值隨著X2值的增大而降低；當芍藥苷濃度(X3)大于5.6 mg/mL時，Y值隨著X3值的增大而降低。

2.4.5根據Box-Behnken法優化醇質體處方的試驗結果進行優化，得到優化后的處方磷脂與膽固醇比例(mg/mg)=5.03，磷脂濃度(mg/mL)=17.62 mg/mL，芍藥苷濃度(mg/mL)=5.19 mg/mL。考慮操作可行性，按照處方磷脂與膽固醇比例(mg/mg)=5.0，磷脂濃度(mg/mL)=18.0 mg/mL，芍藥苷濃度(mg/mL)=5.2 mg/mL制備3批芍藥苷醇質體，測定包封率。結果見表3。試驗值和模型預測值對比，結果絕對偏差小于10%，說明模型Y可以較好地描述因素和響應值之間的關系，能較好地預測分析芍藥苷醇質體的處方。

圖1　效應值Y與(X1和X2)、(X1和X3)、(X2和X3)三因素的三維曲面圖(A)和等高線圖(B)

指標預測值觀察值預測誤差包封率(%)43.1844.27±0.273.43

注： 預測誤差=(預測值-觀察值)/觀察值

2.5芍藥苷醇質體的粒徑分布

按照優化處方制備3批芍藥苷醇質體，分別稀釋100倍后，通過激光粒度分析儀測定粒徑分布，結果呈單峰正態，平均粒徑為(167.77±14.91)nm，多分散系數為(0.41±0.20)(n=3)，見圖2。

圖2　芍藥苷醇質體的粒徑分布圖

2.6變形性考察

考察芍藥苷醇質體在外壓(0.1、0.2和0.3 Mpa)作用下，具有變形透過孔徑為0.22 μm微孔濾膜的能力[12]。先觀測芍藥苷醇質體3 mL透過濾膜的時間，再觀測3 mL水透過濾膜的時間，計算相對透過速率(P)，見公式，結果見表4。結果表明，隨著壓力的升高，P值相應變大。在0.3 MPa壓強作用下，芍藥苷醇質體的P值平均達到62%，可見芍藥苷醇質體具有較好的變形性。

表4　芍藥苷醇質體透過濾膜時間(n=3， s)

注：P=V醇質體/V水×100%

3討論

全文曾嘗試引入包封率、載藥量和綜合評價指標OD值[13]，結果以載藥量和OD值得到的方程擬合情況不好，故無法兼顧包封率和載藥量兩個指標。最終選擇包封率作為優化指標，通過Box-Behnken效應面法優化處方并構建Y模型，模型擬合情況良好，能反映處方的包封率。經驗證，優化處方的包封率的預測值與試驗值吻合情況良好。

通過擬合方程和方差分析，發現處方因素之間存在一定的交互作用，按照對包封率的影響排序：X2X3>X1X2>X1X3，但進一步通過方差分析可見交互作用并不顯著；從擬合方程和方差分析得到二次項X12、X22和X32對Y值影響均顯著。三維曲面圖可看出，響應值均為一曲面，均呈現先升后降的趨勢。X1=5時包封率存在極大值，這是因為膽固醇可增加醇質體膜的致密性，穩定醇質體膜，隨著膽固醇用量的相對減小，在相同質量的脂質膜中，醇質體膜的剛性降低，總表面積增大，所包封的藥物含量增加，包封率增加，但隨著磷脂用量的相對增加，醇質體膜的不對稱性和通透性隨之增加，藥物滲漏增加，致使包封率下降；X2=17時，包封率存在極大值，這是因為包封率通常隨著磷脂濃度的升高而增大，但如果磷脂濃度過大，容易形成多室脂質體，使內水相體積變小，導致包封率也變小[14]；X3=5.6時，包封率存在極大值，這是由于當藥物用量過小，醇質體膜內外藥物濃度差較小，不利于藥物的包裹，導致包封率降低；同時，磷脂對藥物的結合量存在飽和值[15]，當達到該飽和濃度時，藥物將以游離態存在，包封率也將降低。

文獻報道的水溶性藥物的醇質體的包封率從10%～86.42%不等[16-17]，這與制備方法、載體材料、處方水平等多種因素有關。實驗制備的芍藥苷醇質體包封率并不高，若進一步提高芍藥苷這種水溶性藥物的包封率，下一步可以考慮從優選載體材料、擴大各因素水平的設置以及在逆相蒸發法的第一步首先制備成更加穩定的乳劑等方面進行研究。

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(本文編輯： 董歷華)

Preparationand formula optimization of Paeoniflorin ethosomes by Box-Behnken design and response surface method

FENJian-nan,DUShou-ying,BAIjie,etal.

DepartmentofParmarcy，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China

【Abstract】ObjectiveTo optimize the preparation technique for Paeoniflorin ethosome by Box-Behnken design and response surface method. MethodsPaeoniflorin ethosomes was prepared by reverse phase evaporation.The effects of SPC- Cholesterol(X1),concentration of SPC(X2) and concentration of Paeoniflorin(X3)were observed as metrics.The encapsulation efficiency(Y)was evaluated and the formula was optimized by Box-Behnken design and response surface method. ResultsThe optimal formula was ： X1=5.0，X2=18.0，and X3=5.2. The encapsulation efficiency was (44.27±0.27)%.The standardized deviations was below 10%.The average particle size was (167.77±14.91)nm，PDI was (0.41±0.20)(n=3)， deformability was satisfactory. ConclusionUsing Box-Behnken design and response surface method to prepare Paeoniflorin ethosomes is feasible and effective.

【Key words】Paeoniflorin；Ethosomes；Box-Behnken design；Size；Deformability

(收稿日期：2015-12-22)

Corresponding author：DU Shou-ying，E-mail：dushouying@263.net

【中圖分類號】R283

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.04.007

作者簡介：馮健男(1989- )，2013級在讀碩士研究生。研究方向：新劑型與新技術。E-mail：982166557@qq.com通訊作者： 杜守穎(1960- )，女，博士，教授。研究方向：新劑型與新技術。E-mail：dushouying@263.net

基金項目：國家科技重大專項重大新藥創制專項(2014ZX09301306-009)