黃瓜生殖細胞分離及其線粒體DNA的觀察與拷貝數定量分析

唐　綺,藺　禎,高　龍,郭　雪,王丹陽

(西北大學 生命科學學院,西部資源生物與現代生物技術教育部重點實驗室,西安 710069)

?

黃瓜生殖細胞分離及其線粒體DNA的觀察與拷貝數定量分析

唐綺,藺禎,高龍,郭雪,王丹陽*

(西北大學 生命科學學院,西部資源生物與現代生物技術教育部重點實驗室,西安 710069)

摘要:該研究以6～8月上午10點左右摘取的新鮮黃瓜花朵為材料,采用滲透壓沖擊的方法分離黃瓜生殖細胞,并應用競爭型定量PCR技術測定其線粒體DNA數量,分析生殖細胞在發育過程中線粒體DNA的變化,以明確高豐度線粒體DNA的來源,為進一步研究被子植物調控線粒體DNA擴增的分子機制奠定基礎。結果顯示:(1)DAPI染色觀察發現,黃瓜生殖細胞的細胞核周圍存在大量的細胞器DNA熒光點,表明黃瓜生殖細胞的細胞質中存在大量的線粒體DNA。(2)成熟黃瓜生殖細胞平均包含(1 037±126)個線粒體DNA拷貝。(3)成熟生殖細胞內線粒體DNA含量為早期生殖細胞的14.5倍,表明成熟生殖細胞中的線粒體DNA主要來自于生殖細胞形成后其內活躍的線粒體DNA擴增。研究認為,黃瓜生殖細胞內活躍的線粒體DNA是黃瓜線粒體父系遺傳的基礎。

關鍵詞:線粒體DNA;拷貝數;父系遺傳;黃瓜;生殖細胞

植物細胞3個攜帶DNA的細胞器——細胞核、質體及線粒體以不同的方式傳遞DNA到下一代。不同于細胞核的雙親遺傳,葉綠體與線粒體普遍呈現母系遺傳,尤其是線粒體,顯現出更為嚴格的母系遺傳[1-2]。在迄今所研究過的植物中,只有甜瓜、天竺葵、香蕉及黃瓜等少數物種呈現雙親或者父系線粒體遺傳的特征[3-5]。由于線粒體是攜帶DNA的細胞器,因此,線粒體遺傳的本質是線粒體DNA的遺傳。細胞學研究結果表明:對于線粒體雙親或者父系遺傳的物種,其生殖細胞或精細胞總是攜帶豐富的線粒體DNA;而對于母系遺傳的物種,則幾乎不攜帶DNA[6]。因此,線粒體DNA含量與線粒體遺傳模式呈現出高度的相關性。

對于那些雙親或者父系遺傳的物種,其生殖細胞或精細胞都包含線粒體DNA,細胞學方法難以對線粒體DNA含量進行準確的測量。以前的研究運用定量PCR技術測量了天竺葵精細胞及甜瓜生殖細胞中線粒體DNA含量[7]。結果顯示:對于雙親遺傳的天竺葵,其精細胞所攜帶的線粒體DNA數量為(256.7±71.2)個;而對于父系遺傳的甜瓜,其生殖細胞所攜帶的則為(1 296.3±310.6)個。這些定量結果與這兩個物種的線粒體遺傳模式呈現出高度的一致性,即父系遺傳的甜瓜在生殖細胞中線粒體DNA含量遠高于雙親遺傳的天竺葵在精細胞中的線粒體DNA含量。因此,定量研究結果能為我們理解線粒體的遺傳模式提供更為精細的實驗數據。

黃瓜,作為少數幾個線粒體父系遺傳的物種之一,對其生殖細胞中線粒體DNA含量的測定還未見報道。本研究通過分離黃瓜生殖細胞,應用競爭型定量PCR技術測量了其內線粒體DNA含量,分析生殖細胞在發育過程中線粒體DNA的變化,以明確高豐度線粒體DNA的來源,為進一步研究被子植物調控線粒體DNA擴增的分子機制奠定基礎。

1材料和方法

1.1實驗材料

實驗材料黃瓜(C.sativus)在自然條件下于4～8月種植于西北大學果園。新鮮的黃瓜花朵取自上午10:00左右,摘取后立即進行后續的實驗。

1.2方法

1.2.1花粉DAPI壓片在載玻片上,將新鮮花粉置于1滴DAPI(0.1 μg/mL)與固定液(4%多聚甲醛,2%戊二醛,0.1 mol/L二甲砷酸鈉)的混合液中靜置30 s。蓋上蓋玻片后,輕輕用力向一個方向擠壓?；ǚ蹆热菸镆蚴芰Χ粩D壓出花粉。用萊卡倒置顯微鏡DMI3100觀察壓片,用彩色CCD獲取圖像。

1.2.2生殖細胞的分離生殖細胞的分離采用滲透壓沖擊的方法[8]。將新鮮成熟花粉富集于35%蔗糖溶液中,經過1 min離心后(100×g),將上清換成15%蔗糖溶液以進行滲透壓沖擊。在滲透壓變化的沖擊下,花粉將從萌發孔處釋放包含生殖細胞的內容物。將生殖細胞在倒置顯微鏡下用玻璃毛細管于15%蔗糖溶液中清洗3遍后進行富集。生殖細胞的活力用FDA染色方法進行檢測。細胞于0.01% FDA溶液中進行5 min染色后,置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3生殖細胞的消化處理將富集的黃瓜生殖細胞轉移至PCR管中進行消化處理。在消化前,細胞首先經過快速凍融處理以破裂細胞膜。消化液的組成為0.2×Taq酶緩沖液(天根),50 μg/mL蛋白酶K(Merck)。消化條件:56 ℃過夜處理。消化液的用量為每個生殖細胞添加2 μL。

1.2.4定量PCR消化液經過95 ℃變性處理5 min以滅活其中的蛋白酶K。競爭型定量PCR用于定量實驗[7,9]。定量PCR包括2輪PCR擴增。在第1輪PCR擴增中,首先,按普通PCR反應配制5個反應,組分包括1×Taq酶緩沖液、0.2 mmol/L dNTPs、0.6 UTaq酶、雙蒸水及0.4 mmol/L引物對(CmQan1F/CmQan1R)[7];其次,向每個PCR反應液中加入2 μL消化液作為模板,其對應于單個生殖細胞中的線粒體DNA數量;最后,向每個PCR管中加入不同數量的競爭模板cmmatR-(競爭模板cmmatR-來自甜瓜線粒體DNA上的基因matR。由于甜瓜的matR在序列上與黃瓜的matR完全一致,所以cmmatR-也可以用于黃瓜的定量實驗。與matR片段相比,cmmatR-缺失了其內部的113 bp。在定量PCR反應中,由cmmatR-與matR所擴增出的PCR產物大小不同,由此可以在凝膠上進行區分)[7]。PCR反應條件為95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共20個循環。該反應結束后,進行第2輪PCR擴增。以第1輪的反應液1 μL做為第2輪PCR模板,反應循環數為22個循環。其它反應條件如上,僅將引物對換成CmQan2F/CmQan2R[7]。

拷貝數的計算根據2次PCR擴增條帶的灰度值比進行。首先,計算5個PCR反應中2條帶的灰度值比;其次,找出灰度值比接近修正系數0.64的PCR反應(修正系數為當定量模板與競爭模板為1∶1時,其擴增的兩PCR產物的灰度值比)[7];最后,用該PCR反應來計算線粒體DNA的拷貝數,方法為該PCR反應的競爭模板的數量乘以“灰度值比與修正系數”之比。

1.2.5DiOC7/DAPI染色早期的兩核花粉及成熟花粉于固定液中室溫固定4 h。固定液組成為:4%多聚甲醛,2%戊二醛,0.1 mol/L 二甲砷酸鈉。固定的樣品經乙醇脫水后,于Technovit3040樹脂中進行滲透、聚合。實驗流程按產品廠家建議進行。

500 nm厚的切片先于1 μg/mL DiOC7溶液中染色3 min,用蒸餾水清洗2 min后,再于0.1 μg/mL DAPI溶液中染色6 min[6]。所有圖像均在同等條件下拍照獲取,以方便后續DNA含量變化的分析。

為了比較早期生殖細胞與成熟生殖細胞中線粒體DNA變化,統計了這兩個發育時期單個線粒體中的DNA含量變化以及整個生殖細胞中的線粒體數目變化。單個線粒體內的DNA含量變化對應于切片上這兩個時期單個DAPI點的平均灰度值之比(灰度值在Photoshop中進行計算);而線粒體數目的變化則對應于相同細胞質面積內DAPI點的數量之比,細胞質面積在Photoshop中可以用總像素點來表示?？偟木€粒體DNA含量變化則用單個線粒體的DNA含量變化與線粒體數目變化之積來表示。

2結果與分析

2.1黃瓜生殖細胞內的細胞器DNA

用花粉壓片結合DAPI染色技術檢測結果顯示,黃瓜生殖細胞的細胞核周圍存在大量的熒光點(圖1,A,箭標所示),這些核外的熒光點暗示了細胞器DNA的存在。而對照擬南芥精細胞的細胞核周圍并無明顯的點狀熒光信號(圖1,B)。由于遺傳學證據已經顯示黃瓜為線粒體父系遺傳物種[3],因此,這些點狀的熒光信號暗示了線粒體DNA的存在。

盡管黃瓜生殖細胞與擬南芥精細胞在核外細胞器DNA上的DAPI染色結果不同,但是,它們在花粉營養細胞中的染色結果卻是相似的,即都不包含可見的細胞器DNA(圖1,A、B)。這暗示這2個物種的花粉營養細胞僅攜帶少量的細胞器DNA,其含量已經低于DAPI染色所能觀察到的范圍。這與前期的觀察結果是一致的[6]。

2.2黃瓜生殖細胞的分離

為了對成熟黃瓜生殖細胞中的線粒體DNA含量進行準確的測量,我們首先分離、純化了該細胞。在滲透壓變化的沖擊下,生殖細胞會伴隨營養細胞的細胞質從花粉萌發孔處釋放到花粉外(圖2,A箭頭所示)。這些游離的生殖細胞可以通過玻璃毛細管進行小規模富集,圖2,B顯示了富集的29個生殖細胞。FDA染色顯示,分離的生殖細胞在2 h后仍具細胞活力(圖2,C、D)。

A.箭頭所示黃瓜生殖細胞(GC)的細胞質中存在大量的

A.剛從花粉釋放的生殖細胞;B.富集的29個生殖細胞;C、D.FDA染色以指示

2.3黃瓜生殖細胞中線粒體DNA拷貝數的定量

分離得到的29個生殖細胞,在經過快速的凍融處理后,于58 μL消化液中進行消化處理以釋放模板DNA。2 μL消化產物(平均對應于1個生殖細胞)被用來作為單個定量PCR反應的模板。在每次的定量實驗中,設置5個定量PCR反應。每個PCR反應除了包含相同數量的線粒體DNA模板(數量未知)外,還包含不同數量的競爭模板cmmatR-(競爭模板的數量是已知的)。從PCR產物的凝膠電泳結果可以看見,隨著競爭型模板的逐漸增加,由其擴增而來的PCR產物的條帶亮度逐漸遞增(339 bp條帶),同時,由線粒體DNA擴增而來的條帶亮度逐漸減弱(452 bp)。這表明兩擴增產物在PCR反應中表現出明顯的競爭關系,暗示了定量結果是可靠的。選取了兩PCR條帶灰度值比接近參考系數(0.64)的PCR反應來計算線粒體DNA的拷貝數(圖3,A～C)。3次實驗結果分別為1 093個、893個及1 125個。因此,單個黃瓜生殖細胞平均攜帶的線粒體DNA拷貝數為(1 037±126)個。

圖3　黃瓜生殖細胞線粒體DNA拷貝數的定量分析

A、B.顯示早期生殖細胞的DiOC7(A)及DAPI(B)染色;C、D.顯示成熟生殖細胞的DiOC7(C)及DAPI(D)染色;

2.4生殖細胞中線粒體DNA的擴增

為了調查成熟生殖細胞產生如此高豐度線粒體DNA的原因,比較了早期生殖細胞與成熟生殖細胞中的線粒體DNA含量。生殖細胞最早出現于小孢子第一次不對稱有絲分裂,這次分裂產生了1個體積較大的營養細胞和1個體積較小的生殖細胞(早期生殖細胞)。鑒于早期生殖細胞難以分離,運用切片技術與DiOC7/DAPI染色來研究線粒體DNA的變化。在切片上,DiOC7染色能夠顯示生殖細胞中的線粒體(圖4,A和C中M所示),其相對應的DAPI點能指示線粒體DNA的含量(圖4,B、D箭頭所示)。結果顯示:成熟生殖細胞中的DAPI染色點在熒光信號上是早期生殖細胞的4.4倍(圖4,E),同時,成熟生殖細胞中的熒光點在單位面積上出現的頻率是早期生殖細胞的3.3倍,暗示總的線粒體數目增加了3.3倍(圖4,F)。因此,在發育過程中,成熟生殖細胞中的線粒體DNA含量增加為早期生殖細胞的14.5倍。這表明成熟生殖細胞中的線粒體DNA主要來自于生殖細胞形成后其內活躍的線粒體DNA擴增。

3討論

在本研究中,我們定量分析了黃瓜生殖細胞中的線粒體DNA數量。黃瓜生殖細胞平均攜帶(1 037±126)個線粒體DNA拷貝。這與同屬植物甜瓜生殖細胞的線粒體DNA含量相似(1 296±310)[7]。如此高豐度的線粒體DNA主要來自于生殖細胞內活躍的線粒體DNA擴增。這包括兩方面的原因:單個線粒體內DNA含量的增加以及生殖細胞內總線粒體數量的增加。這可能是黃瓜線粒體父系遺傳的主要原因。

基因組測序結果表明,黃瓜核基因組和線粒體基因組的大小分別為243.5 Mb與1 568 kb[10-11]。在成熟生殖細胞中(核基因組的復制已經完成),其核DNA的含量為487 Mb,而線粒體DNA的含量為1 626.0 Mb(1 037×1 568 kb)。因此,黃瓜生殖細胞所攜帶的線粒體DNA含量是其核DNA含量的3.3倍。這種核外線粒體DNA含量大于核DNA含量的現象在植物細胞中并不常見。目前,僅在天竺葵卵細胞中報道過[12]?？紤]到核基因組與線粒體基因組共用了一些與DNA復制相關的原料,這提示生殖細胞中可能存在某種機制使得線粒體能高效地利用DNA復制所需要的各種物質。

在被子植物中,體細胞平均攜帶約50個線粒體DNA拷貝[7,13]。在體細胞的分裂過程中,線粒體DNA僅復制1倍后平均分配到2個子細胞中。目前,我們并不清楚是什么機制維持了體細胞中的線粒體DNA僅發生1倍的增加？但是,與體細胞不同,黃瓜生殖細胞卻發生了14.5倍的線粒體DNA擴增。這表明體細胞中維持線粒體DNA數量的機制在黃瓜生殖細胞中并不能正常行使功能。因此,在黃瓜生殖細胞中,可能存在或者缺失了某些因子,使得線粒體DNA發生了超量復制。解析這些因子,有助于我們理解線粒體DNA數量控制的基本生命科學問題。近來,研究者們已用RT-PCR方法從分離的百花丹與煙草精細胞構建了各自的cDNA文庫[14-15],進而解析了大量精細胞表達的基因。利用該方法并結合黃瓜生殖細胞的分離技術,使得我們可以獲得黃瓜生殖細胞的轉錄組;同時,鑒于黃瓜基因組的測序已經完成,這使得我們可以利用黃瓜生殖細胞作為實驗材料來研究被子植物調控線粒體DNA擴增的分子機制。

參考文獻:

[1]MOGENSEN H L.The hows and whys of cytoplasmic inheritance in seed plants[J].AmericanJournalofBotany,1996,83(3):383-404.

[2]ZHANG Q,LIU Y,SODMERGEN.Examination of the cytoplasmic DNA in male reproductive cells to determine the potential for cytoplasmic inheritance in 295 angiosperm species[J].PlantCellandPhysiology,2003,44(9):941-951.

[3]HAVEY M J,MCCREIGHT J D,RHODES B,etal.Differential transmission of theCucumisorganellar genomes[J].TheoreticalandAppliedGenetics,1998,97(1):122-128.

[4]FAURE S,NOYER J L,CARREEL F,etal.Maternal inheritance of chloroplast genome and paternal inheritance of mitochondrial genome in bananas (Musaacuminata)[J].CurrentGenetics,1994,25(3):265-269.

[5]ANDREAS W,JANINA A,FRANK P,etal.Biparental inheritance of plastidial and mitochondrial DNA and hybrid variegation inPelargonium[J].MolecularGeneticsandGenomics,2009,282(6):587-593.

[6]NAGATA N,SAITO C,SAKAI A,etal.The selective increase or decrease of organellar DNA in generative cells just after pollen mitosis one controls cytoplasmic inheritance[J].Planta,1999,209(1):53-65.

[7]WANG D Y,ZHANG Q,LIU Y,etal.The levels of male gametic mitochondrial DNA are highly regulated in angiosperms with regard to mitochondrial inheritance[J].ThePlantCell,2010,22(7):2 402-2 416.

[8]魯云龍,魏麗勤,戴紹軍,等.被子植物生殖細胞與精細胞的分離方法[J].植物學報,2014,49(3):229-245.

LU Y L,WEI L Q,DAI S J,etal.Current methods used to isolate and purify generative and sperm cells from pollen grains and tubes of flowering plants[J].ChineseBulletinofBotany,2014,49(3):229-245.

[9]GILLILAND G,PERRIN S,BLANCHARD K,etal.Analysis of cytokine mRNA and DNA:detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1990,87(7):2 725-2 729.

[10]HUANG S,LI R,ZHANG Z,etal.The genome of the cucumber,CucumissativusL[J].NatureGenetics,2009,41(12):1 275-1 281.

[11]ALVERSON A J,RICE D W,DICKINSON S,etal.Origins and recombination of the bacterial-sized multichromosomal mitochondrial genome of cucumber[J].ThePlantCell,2011,23(7):2 499-2 513.

[12]KUROIWA H,NISHIMURA Y,HIGASHIYAMA T,etal.Pelargoniumembryogenesis:cytological investigations of organelles in early embryogenesis from the egg to the two-celled embryo[J].SexualPlantReproduction,2002,15(1):1-12.

[13]PREUTEN T,CINCU E,FUCHS J,etal.Fewer genes than organelles:extremely low and variable gene copy numbers in mitochondria of somatic plant cells[J].ThePlantJournal,2010,64(6):948-959.

[14]XIN H P,PENG X B,NING J,etal.Expressed sequence-tag analysis of tobacco sperm cells reveals a unique transcriptional profile and selective persistence of paternal transcripts after fertilization[J].SexualPlantReproduction,2011,24(1):37-46.

[15]GOU X P,YUAN T,WEI X P,etal.Gene expression in the dimorphic sperm cells ofPlumbagozeylanica:transcript profiling,diversity,and relationship to cell type[J].ThePlantJournal,2009,60(1):33-47.

(編輯:宋亞珍)

Isolation of Generative Cell ofCucumissativusand Mitochondrial DNA Observation and Copy-number Quantification Analysis

TANG Qi,LIN Zhen,GAO Long,GUO Xue,WANG Danyang*

(Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China,Ministry of Education,College of Life Science,Northwest University,Xi’an 710069,China)

Abstract:In this study,we collected fresh flowers from Cucumis sativus around 10:00(am) from June to August,isolated the generative cells (GC) of C.sativus with the method of osmotic shock,quantified its mitochondrial DNA (mtDNA) contents through employing the competitive quantitative PCR technology,and analyzed the change of mtDNA contents in GC during its development,in order to investigate the origin of the abundant mtDNA,and lay the foundation for further study on the molecular mechanism of regulation of mitochondrial DNA amplification in angiosperm.The results showed that:(1)DAPI staining represents abundant fluorescence points of organellar DNA around the nucleus of GC of C.sativus,indicating the presence of a large number of mtDNA in cytoplasm of cucumber GC.(2)The single mature GC of C.sativus averagely owns (1 037±126) mtDNA copies.(3)Compared with early GC,the mature GC up-regulates the mtDNA by 14.5 times,suggesting that mtDNA in mature GC is mainly from its active amplification after GC formation.The study suggests that the active increase of mtDNA in GC is the basis of the paternal mitochondrial inheritance of C.sativus.

Key words:mtDNA;copies;paternal inheritance;Cucumis sativus;generative cell(GC)

中圖分類號:Q349+.51;Q753

文獻標志碼:A

作者簡介:唐綺(1991-),女,碩士,主要從事被子植物生殖生物學研究。E-mail:583208677@qq.com*通信作者:王丹陽,副教授,碩士生導師,主要從事被子植物生殖生物學研究。E-mail:wangdy@nwu.edu.cn

基金項目:國家自然科學基金(31200234);陜西省教育廳科研計劃(14JS089)

收稿日期:2015-10-12;修改稿收到日期:2016-01-17

文章編號:1000-4025(2016)03-0429-06

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.03.0429