石榴果肉PgF3′5′H基因克隆及不同溫度處理下的表達分析

關曉彎,陳　磊,涂佳麗,張水明

(安徽農業大學 園藝學院,合肥 230036)

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石榴果肉PgF3′5′H基因克隆及不同溫度處理下的表達分析

關曉彎,陳磊,涂佳麗,張水明*

(安徽農業大學 園藝學院,合肥 230036)

摘要:為探討不同溫度處理對采后石榴果肉花青苷含量的影響及花青苷合成相關基因(F3′5′H)在石榴果肉花青苷生物合成途徑中的作用,該研究以“玉石籽”石榴為試材,于不同溫度(0 ℃、5 ℃、10 ℃、15 ℃)處理下測定石榴果肉花青苷含量,同時利用RACE技術克隆了石榴果肉花青苷合成相關基因,命名為PgF3′5′H,GenBank登錄號為KU058892;并利用RT-PCR技術分析PgF3′5′H基因在不同貯期溫度下石榴果肉中的表達特性。結果表明:(1)不同溫度處理下,石榴果肉花青苷含量隨著貯藏時間(0～56 d)的增長呈上升趨勢;在整個貯藏過程中,15 ℃條件下,花青苷含量最高,10 ℃次之,5 ℃和0 ℃則處于較低水平;15 ℃時花青苷含量在14 d后表現不穩定。(2)PgF3′5′H基因全長cDNA為1 199 bp,開放閱讀框918 bp,編碼305個氨基酸,在N端36～39處含有細胞色素P450家族基因的特征保守氨基酸序列(CYP基序“PPGP”);生物信息學分析表明,該基因編碼的氨基酸序列與巨桉的EgF3′5′H2、麻風樹的JcF3′5′H2和荷花的NnF3′5′H2氨基酸序列一致性分別高達86%、82%和81%。(3)在0 ℃、5 ℃、10 ℃處理條件下,石榴果肉PgF3′5′H基因表達量隨著貯藏時間(0～56 d)的延長均呈上升趨勢,15 ℃處理下,石榴果肉PgF3′5′H基因表達量不穩定;石榴果肉PgF3′5′H基因表達與花青苷含量呈顯著正相關關系。研究結果為深入探討采后石榴果肉花青苷的含量變化奠定了基礎。

關鍵詞:石榴果肉;花青苷;溫度;PgF3′5′H;RACE;RT-PCR

石榴(PunicagranatumL.)屬于石榴科石榴屬,為多年生落葉喬木或灌木,是最早發現的可食用水果之一[1]。近年來,由于石榴具有多種醫療保健作用受到人們越來越多的重視[2]。石榴果肉中含有豐富的花青苷,花青苷是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素,主要存在于彩色植物葉片、花或種子的葉肉細胞和表皮細胞的液泡中[3]。花青苷具有顯著的抗氧化、抗炎、抑菌、防止肝脂肪積聚及變性、防治心血管疾病、抑制多種癌細胞生長等多種生理活性,在食品、醫藥、化妝等領域有著廣泛的應用前景[4]。但花青苷是一類不穩定的物質,其生物合成和積累易受環境因子的調節[5-6],溫度是其中的一個主要的環境因子,不僅能影響花青苷生物合成的速率,而且可以對其積累量和穩定性產生作用[7],這在葡萄[8]、長葉車前[9]、馬鈴薯[10]等研究中已得到證實。而溫度對采后石榴果肉中花青苷含量的影響方面的研究還未見報道。

花青苷合成代謝涉及多個結構基因、調節基因的相互作用,基因編碼的酶決定了花青苷合成的種類[11]。花青苷的生物合成主要由苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮異構酶(CHI)、黃烷酮3-羥化酶(F3H)、類黃酮3′羥基化酶(F3′H)、類黃酮3′,5′羥基化酶(F3′5′H)、二羥基黃酮醇還原酶(DFR)、花青苷合成酶(ANS)以及類黃酮3-O-糖基轉移酶(UFGT)等多種酶基因調控[12-13]。其中CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和UFGT等基因已在石榴中克隆[1],而在石榴中尚未見到關于花青苷合成相關基因(F3′5′H)的研究報道。國內外研究表明,F3′5′H基因在仙客來[14]、馬鈴薯[15]等很多植物中已經克隆,通過調節花青苷的生物合成途徑,從而影響花青苷的種類和含量。

本研究以安徽懷遠“玉石籽”石榴為試材,研究采后不同貯藏溫度(0 ℃、5 ℃、10 ℃、15 ℃)對石榴果肉花青苷含量的影響。同時利用RACE技術克隆花青苷合成相關基因(PgF3′5′H)cDNA全長,然后利用RT-PCR技術分析該基因在不同貯期溫度石榴果肉中的表達特性,為深入研究采后石榴果肉花青苷的含量變化奠定基礎。

1材料和方法

1.1實驗材料

供試材料為‘玉石籽’的成熟果實,于2014年9月16日采自安徽省蚌埠市懷遠縣,選擇成熟度相同、果形勻稱、大小一致(約300 g)和無機械傷的果實,置于4 ℃條件下預冷72 h后,將果實分成4批分別置于0 ℃、5 ℃、10 ℃和15 ℃條件下。定期(0、14、28、42和56 d)取樣,并模擬貨架期,置于20 ℃恒溫環境條件下7 d后,剝取籽粒,液氮速凍后,于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2花青素苷含量的測定

采用pH示差法[16]分別對不同貯藏溫度不同貯藏期石榴果肉的花青苷含量進行測定:取混合石榴籽粒解凍,冰上研磨后,迅速轉移至離心管稱重,7 000 r/min離心10 min,收集上清液,記錄上清液體積;取上清液1 mL,分別用0.4 mol/L KCl-HCl緩沖溶液(pH 1.0)和0.4 mol/L醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.5)稀釋至5 mL,混勻,室溫放置20 min;用蒸餾水作對照,在510和700 nm下測定光密度值,重復3次。

石榴果肉中花青苷含量(mg/g)=△A×M×DF×V×100/(m×ε×L),其中:A=(A510 nm-A700 nm)pH 1.0-(A510 nm-A700 nm)pH 4.5;M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質量(449.2 g/mol);DF為稀釋因子;V為石榴汁體積(mL);m為稱取的石榴果肉質量(g);ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾比吸收系數(26 900 L·mol-1·cm-1)]，L為光程,1 cm。

1.3PgF3′5′H基因cDNA全長克隆

1.3.1PgF3′5′H基因中間片段的獲得依據GenBank中已經登錄的其他植物F3′5′H基因的DNA結合結構域保守區,使用軟件Primer Premier 5.0設計目的片段的擴增引物F3′5′H-F和F3′5′H-R(表1),獲取基因同源片段。利用艾德萊RNA試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取“玉石籽”石榴果肉總RNA,用M-MLV反轉錄酶(Promega公司)合成cDNA,以其為模板進行PCR反應。反應條件為:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環;72 ℃延伸10 min,PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產物進行回收并連接至PGEM-Teasy載體(Promega)上,轉化大腸桿菌DH5α(上海康潤生物公司)進行克隆,挑取陽性單菌落進行測序。

1.3.2PgF3′5′H基因末端擴增及全長cDNA拼接根據獲得的F3′5′H中間片段核苷酸序列,設計用于3′端和5′端克隆的基因特異性引物(表1)。參照SMARTerTMRACE cDNA擴增試劑盒(Clontech公司)說明書,以3′-CDS Primer A為接頭,反轉錄得到3′-RACE-Ready cDNA,以5′-CDS Primer和BD SMART Ⅱ A oligo為接頭,反轉錄得到5′-RACE-Ready cDNA。

采用巢式PCR法進行5′端擴增,F3′5′H-5′GSP1外特異性引物與UPM-Long作為第1輪擴增引物,以此PCR產物為模板,F3′5′H-5′GSP2內特異性引物與NUP作為引物進行第2輪擴增,獲得F3′5′H基因的5′端序列,兩輪擴增程序相同,退火溫度分別為55 ℃和60 ℃。回收擴增產物并連接至PGEM-Teasy載體,轉化大腸桿菌DH5α進行克隆,篩選陽性單菌落進行測序。分別用特異性引物F3′5′H-3′GPS1、F3′5′H-3′GPS2和通用引物UPM-Long和NUP,進行3′端擴增,兩輪退火溫度分別為55 ℃和58 ℃,擴增方法參照5′端擴增。將所得的5′端序列、3′端序列和目的片段進行拼接,獲得PgF3′5′H基因的全長序列。

1.4PgF3′5′H基因的生物信息學分析

將PgF3′5′H基因序列在NCBI數據庫中運用Blast工具進行序列比對和同源性分析;運用Finder軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)查找并翻譯開放閱讀框;運用ExPASy-Protparam Tool(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質的理化性質;運用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進行蛋白質保守結構域搜索;運用Claustalx和GENEDOC軟件進行氨基酸序列比對和相似性分析;運用MEGA5軟件構建系統進化樹。

1.5石榴果肉PgF3′5′H基因在不同貯期溫度的表達分析

利用艾德萊RNA試劑盒提取不同溫度(0 ℃、5 ℃、10 ℃、15 ℃)處理石榴果肉的總RNA,采用Takara公司的PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒將總RNA

表1　本實驗相關引物序列

反轉錄為cDNA。根據PgF3′5′H基因的全長序列,使用軟件Primer Premier 5.0設計熒光定量PCR引物PgF3′5′H-F/PgF3′5′H-R(表1)。分別以不同處理的cDNA為模板,采用Actin基因作為內標對樣品的cDNA模板量進行校準,進行特異性表達分析。反應體系按TaKaRa SYBR Premix ExTaq試劑盒步驟進行操作:SYBR Premix ExTaq(2×)為10 μL,ROX Peference Dye(50×)為0.4 μL,模板為2 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL,ddH2O為6.4 μL,總體系為20 μL。PCR擴增反應程序為:95 ℃預變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共40個循環。每個樣品各設置4個重復,以ROX作為熒光校正,使用2-△△Ct法進行相對表達量分析。

2結果和分析

2.1不同溫度處理石榴果肉花青苷含量分析

采用pH示差法測得不同溫度不同貯藏期石榴果肉的花青苷含量(圖1)。在0℃和5℃貯藏條件下,石榴果肉花青苷含量在貯藏0～14 d過程中快速升高,花青苷含量差異均達到顯著水平;貯藏14～42 d期間,花青苷含量處于一個比較穩定的階段;貯藏42～56 d期間,花青苷含量急劇上升,達到最大值,分別為0 d的2.03和2.88倍。在10 ℃條件下,貯藏0～42 d期間,花青苷含量呈快速上升趨勢,到42 d時達到高峰,為0 d的3.25倍,且各個階段花青苷含量差異性均達到顯著水平;到56 d時,花青苷含量開始緩慢下降,僅次于42 d。在15 ℃條件下,貯藏0～14 d花青苷含量快速上升,達到第一個高峰,為0 d的3.19倍;貯藏14～28 d開始緩慢下降,28～56 d又開始回升,到56 d時達到最高峰,為0 d的4.17倍,花青苷含量雖一直處于最高水平,但不穩定。結果表明:不同溫度(0℃、5℃、10℃、15 ℃)處理條件下,石榴果肉花青苷含量隨著貯藏時間(0～56 d)的增長均呈不斷上升趨勢;在整個貯藏過程中,15 ℃處理條件下,花青苷含量一直處于最高水平,10 ℃次之,5 ℃和0 ℃則處于較低水平。

2.2石榴PgF3′5′H基因的克隆

根據基因特異引物F3′5′H-F/F3′5′H-R擴增石榴果肉中F3′5′H基因目的片段,電泳回收后進行連接轉化,篩選陽性克隆,測序得到一個367 bp的核酸片段(圖2,A)。測序結果在NCBI網站的Blast中進行比較,發現該片段序列與錦繡杜鵑(Rhododendron×pulchrum)的RpF3′5′H(AB289598.1)的序列一致性高達80%,初步判斷該片段為石榴F3′5′H基因序列片段。

5′端擴增得到一個486 bp的片段(圖2,B),其5′端發現起始密碼子ATG。NCBI序列對比結果顯示,該片段序列與巨桉(Eucalyptusgrandis)的EgF3′5′H2-like(XM_010046774.1)的序列一致性高達83%,說明已克隆到石榴F3′5′H基因cDNA的5′端序列。3′端擴增得到一個503 bp的片段(圖2,C),其3′端發現終止密碼子TAA和PolyA尾巴,說明已到達3′末端。NCBI序列對比結果顯示,該片段序列與山字草(Clarkiaarcuata)的CaF3′5′H1(KC019237.1)的序列一致性高達81%,分析確定為石榴F3′5′H基因的3′序列。將獲得的3′段序列、5′段序列和目的片段序列進行拼接,得到一個長1 199 bp的cDNA序列。

小寫字母表示同一溫度不同貯期

M.DL2000;A.PgF3′5′H;B.5′-RACE;C.3′-RACE

2.3PgF3′5′H基因生物信息學分析

通過NCBI的ORF Finder分析,PgF3′5′H基因全長cDNA為1 199 bp,其中包含5′非編碼區115 bp,3′非編碼區166 bp和開放閱讀框918 bp,編碼一個含有305個氨基酸的蛋白質,起始密碼子為ATG,終止密碼子為TAA(圖3)。將其命名為PgF3′5′H,GenBank登錄號為KU058892。

Protparam分析其理化性質,推測該蛋白分子式為C1546H2477N419O404S23,相對分子量為34 135.6,等電點為9.89,理論推導其半衰期大約為30 h,不穩定參數為42.85,蛋白質性質不穩定(40以下為穩定蛋白);該蛋白中相對含量較多的氨基酸是亮氨酸Leu(10.5 %,32個)和丙氨酸Ala(9.2%,28個),含量較少的是半胱氨酸Cys(1.0%,3)和色氨酸Trp(1.3%,4個);總的帶負電荷殘基(Asp + Glu)為25,總的帶正電荷殘基(Arg + Lys)為41;脂肪族氨基酸指數為94.33,總平均疏水指數(GRAVY)為0.097,該蛋白為疏水性蛋白。

將PgF3′5′H基因編碼的氨基酸序列進行同源性分析(圖4),結果發現,該氨基酸序列與巨桉EgF3′5′H2、麻風樹JcF3′5′H2和荷花NnF3′5′H2的氨基酸一致性較高,均達到80%以上。NCBI保守結構域搜索結果顯示,PgF3′5′H氨基酸序列含有細胞色素P450家族基因的特征保守氨基酸序列:N端36～39處的CYP基序“PPGP”,為連接膜的錨定位點和酶蛋白的球體部分,在不同的物種中是高度保守區[17]。將PgF3′5′H推導的氨基酸序列與其它植物中調控花青苷合成代謝的F3′5′H氨基酸序列進行比對,并構建系統進化樹(圖5),發現PgF3′5′H與巨桉EgF3′5′H2(Accession:XP_010045081.1)的進化關系相對較近。

方框中堿基序列ATG表示起始密碼子;*表示終止密碼子TAA

圖中從上至下依次代表的是石榴、巨桉、荷花、黑果茶藨、麻風樹、甜橙、可可、

節點數字表示Bootstrap驗證中基于1 000次重復的可信度(大于30%顯示);標尺代表遺傳距離;括號內編號為氨基酸登錄號

2.4不同溫度處理石榴果肉PgF3′5′H基因的差異表達分析

應用RT-PCR技術分析PgF3′5′H基因在不同貯期溫度石榴果肉中的表達特性(圖6)。在0 ℃貯藏條件下,0～14 d期間,PgF3′5′H基因表達量一直處于一個較低水平;14～42 d,PgF3′5′H基因表達量快速上升,達到高峰,為0 d基因表達量的3.54倍,且各階段基因表達量差異顯著;56 d又開始下降,僅次于42 d。在5 ℃和10 ℃條件下,PgF3′5′H基因表達量均呈現快速上升趨勢,到56 d時,基因表達量分別為0 d的5.51和4.02倍;在15 ℃貯藏條件下,0～14 d期間,PgF3′5′H基因表達量急劇上升,14 d時達到第一個高峰,為0 d基因表達量的3.99倍;14～42 d期間,基因表達量急劇下降,下降了2.48倍,且各個階段基因表達量差異顯著;到56 d時,基因表達量又急劇上升,達到最大值,為0 d基因表達量的5.26倍。結果表明:在0 ℃、5 ℃、10 ℃處理條件下,石榴果肉PgF3′5′H基因表達量隨著貯藏時間(0～56 d)的增長呈不斷上升趨勢；在15 ℃處理條件下,石榴果肉PgF3′5′H基因表達量14 d后表現不穩定。

用SPSS軟件對不同溫度處理石榴果肉PgF3′5′H基因表達量與花青苷含量(圖1)進行相關性比較分析可知,PgF3′5′H基因表達與花青苷含量呈顯著正相關(r=0.742,P<0.05)。

小寫字母表示同一溫度不同貯期相對表達量0.05水平差異顯著性

3討論

本研究通過分析不同溫度貯期石榴果肉的花青苷含量發現:適當的低溫(10 ℃)促進花青苷含量增長,這在許多植物中已經得到證實。如Yamane等[18]對葡萄、謝興斌[19]對蘋果、李智[20]對茶樹的研究表明,適當的低溫條件促進葡萄皮、蘋果皮、茶樹芽葉花青苷積累。而在較低溫度(0 ℃和5 ℃)貯期下,石榴果肉花青苷含量增長緩慢,張學英等[21]對李的研究表明,李果實在0 ℃低溫下的花青苷含量積累緩慢,說明促進植物花青苷積累的低溫也是有一定閾值范圍的,非常低的溫度不利于花青苷的合成。溫度稍高(15 ℃)時,石榴果肉花青苷含量不穩定。Huh等[22]對菊花、Poudel等[23]對葡萄的研究表明,高溫(30 ℃左右)會影響花青苷的穩定性,也就是說當溫度升高時,花青苷的合成速率會減慢,降解速率卻增加,進而導致花青苷的積累量降低,至于高溫對采后石榴果肉花青苷積累及穩定性的影響,還有待進一步研究。可見,溫度不僅影響采后石榴果肉花青苷積累,還影響其穩定性。

經過F3′5′H氨基酸多序列比對發現,PgF3′5′H含有與其他F3′5′H相似的保守區,不同物種F3′5′H氨基酸序列的主要差異存在于N端約31個氨基酸,這段序列主要含有疏水氨基酸殘基,是膜插入點的信號序列[24]。F3′5′H屬于細胞色素P450家族的單加氧酶[11],細胞色素P450家族基因含有3個特征保守氨基酸序列:N端CYP基序“PPGP”、I螺旋基序“AGTDT”和血紅素(HBR)結合區域序列“FGAGRRICAG”[17]。PgF3′5′H僅含有CYP基序,缺少I螺旋基序和HBR結合區域序列,這與矮牽牛(Petunia×hybrida)的PhF3′5′H氨基酸序列(BAF64483.1)相一致。至于這些基序的缺乏對石榴果肉花青苷的生物合成有什么具體影響,還需要進一步驗證。

通過RT-PCR技術分析發現,不同溫度貯期石榴果肉PgF3′5′H基因的相對表達量存在差異:適當的低溫(5 ℃和10 ℃)促進PgF3′5′H基因的表達;而在較低溫度(0 ℃)下,PgF3′5′H基因的表達量增長緩慢;溫度稍高(15 ℃)時,石榴果肉PgF3′5′H基因的表達量雖然顯著上升,但不穩定。可見,溫度影響PgF3′5′H基因的表達。另外,不同貯期溫度石榴果肉PgF3′5′H基因表達與花青苷含量呈顯著正相關,推測PgF3′5′H基因促進石榴果肉花青苷的合成。這與近年來國內外許多研究結果相一致,如葡萄(Vitisvinifera)VvF3′5′H[25]和月季(Rosahybrida)RhF3′5′H[26]基因的表達有助于花青苷含量的增長。另外,通過轉基因技術引入外源F3′5′H基因來改變植物花青苷積累,已在多種植物上獲得成功,如風鈴草(Campanulamedium)的CmF3′5′H基因[27]和野茶樹(Camelliasinensis)的CsF3′5′H基因[28]轉化煙草,轉化株系中均提高了花青苷含量。花青苷是影響石榴品質的一個重要因子,由于花青苷生物合成途徑復雜,至于其他結構基因、調節基因和環境因子對采后石榴果肉花青苷積累的影響,還有待進一步研究。

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(編輯:宋亞珍)

Clone ofPgF3′5′HGene in Pomegranate Pulp and Its Expression under Different Temperature Treatments

GUAN Xiaowan,CHEN Lei,TU Jiali,ZHANG Shuiming*

(College of Horticulture,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)

Abstract:To explore the effects of different temperature treatments on anthocyanin contents of postharvest pomegranate pulp,and the function of anthocyanin biosynthesis-related gene (F3′5′H) in anthocyanin biosynthesis pathway of pomegranate pulp,taking pomegranate cultivar ‘Yushizi’ as test materials,we measured anthocyanin contents of pomegranate pulp under different temperature (0 ℃,5 ℃,10 ℃,15 ℃) treatments.At the same time a anthocyanin biosynthesis-related gene was cloned from pomegranate pulp by RACE,named PgF3′5′H(GenBank accession:KU058892).The expression levels of PgF3′5′H in pomegranate pulp during different temperature storage periods were analyzed by RT-PCR.The results showed that:(1)under different temperature treatments,anthocyanin contents of pomegranate pulp showed a rising trend as the storage time (0-56 d) went on;In the whole storage time,anthocyanin contents were the highest under 15 ℃ treatments,secondly 10 ℃,5 ℃ and 0 ℃ at lower levels;Anthocyanin contents under 15 ℃ were unstable after 14 d.(2)The full-length cDNA of PgF3′5′H was 1 199 bp with an open reading frame of 918 bp encoding 305 amino acids.The 36th to 39th amino acids of the N-terminus of PgF3′5′H contained the characteristic conserved sequences (CYP motif “PPGP”) of the cytochrome P450 family genes;Bioinformatics showed that the amino acid sequences of PgF3′5′H had high consistency with Eucalyptus grandis EgF3′5′H2,Jatropha curcas JcF3′5′H2 and Nelumbo nucifera NnF3′5′H2 as 86%,82% and 81%,respectively.(3)The expression levels of PgF3′5′H showed a rising trend as the storage time (0-56 d) went on under 0 ℃,5 ℃ and 10 ℃ treatments,being unstable under 15 ℃;The relative expression of PgF3′5′H was significantly positively correlated with anthocyanin contents of pomegranate pulp.The research results laid the foundation for exploring the changes of anthocyanin contents in postharvest pomegranate pulp.

Key words:pomegranate pulp;anthocyanin;temperature;PgF3′5′H;RACE;RT-PCR

中圖分類號:Q785;Q786

文獻標志碼:A

作者簡介:關曉彎(1989-),女,在讀碩士研究生,主要研究果樹資源與生物技術育種。E-mail:15256564232@163.com*通信作者:張水明,博士,副教授,主要從事園藝植物種質資源與生物技術育種研究。E-mail:zhangshm893@sohu.com

基金項目:國家自然科學基金(30900971)

收稿日期:2015-12-26;修改稿收到日期:2016-02-01

文章編號:1000-4025(2016)03-0435-09

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.03.0435